CMV抗體免疫金快速檢測試劑盒的開發(fā)與初步應(yīng)用(1)

1、    CMV抗體免疫金快速檢測試劑盒的開發(fā)與初步應(yīng)用(1)    】 目的： 開發(fā)一種低成本、簡單易用的基于免疫金滲濾法的試劑盒，以用于檢測分析血清中的巨細胞病毒抗體. 方法： 將用人工合成的人巨細胞病毒(HCMV)抗原表位的線性肽和分支多抗原肽分別劃線固定于硝酸素纖維膜上，制成免疫層析檢測試紙條，血清中IgG與測試條上金標記物結(jié)合后沿硝酸纖維素膜移動，與膜上的固相抗原結(jié)合形成肉眼可見的紅色帶條并用GICA和ELISA試劑盒對比檢測120份血清標本中抗HCMV抗體. 結(jié)果： 分支多抗原肽制成的免疫層析檢測試紙條的

2、靈敏度為97.9%，特異度為87.5%，兩法符合率為95.8%. 結(jié)論： GICA檢測血清中的抗HCMV抗體特異性強，靈敏度高，簡便快速，有廣泛應(yīng)用價值.【關(guān)鍵詞】 人巨細胞病毒；分支多抗原肽；膠體金；酶聯(lián)免疫吸附測定0引言人巨細胞病毒（HCMV）感染的普遍性和嚴重性已引起醫(yī)學(xué)界的高度重視1. 但HCMV感染時，臨床癥狀變化很大，可隨患者年齡、機體狀況、感染途徑不同而異. 現(xiàn)今實驗室檢測手段包括ELISA檢測患者血清中IgG和IgM，套式PCR技術(shù)檢測血清HCMV的DNA，RTPCR檢測HCMV的mRNA以及病毒培養(yǎng)等，但由于以上方法耗時耗力2，且檢測費用較高，不適合在基層臨床醫(yī)療機構(gòu)的普及性

3、篩查. 為此，我們采用人工合成的包含HCMV抗原表位的線形多肽以及多抗原肽，采取膠體金免疫層析法3，對HCMV進行快速檢測. 1材料和方法1.2.1HCMV抗原表位設(shè)計參照文獻4，根據(jù)KyteDoolittle親水性方案預(yù)測B細胞表位結(jié)果設(shè)計合成了HCMVgp55抗原表位序列如下：VTSGSTKD （aa 798 to 805）. 1.2.2線性肽的合成將PACPEGPS樹脂 0.5 g（替代度0.2 mmol/g）用二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30 min，進行活化. 采用對稱酸酐法將已經(jīng)活化的樹脂進行第一個氨基酸的連接. 稱取待連接的氨基酸 195 mg，加入1.5 mL二氯甲烷DCM和3滴

4、DMF使之溶解，加入1mol/L二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP） 275 mL，磁力攪拌，室溫下反應(yīng)15 min，過濾除去沉淀，蒸發(fā)掉過濾液中的溶劑，得到對稱酐. 將對稱酐溶于最少量的DMF中（保證最大濃度），加入到活化的樹脂中，搖動1 min，然后加入0.1 mol/L 4二甲氨基吡啶(DMAP)/DMF 460 L，搖動反應(yīng)90 min，吹去反應(yīng)液，用10 mL DMF洗滌3次，吹干. 其余7個氨基酸的連接采用原位活化法，將連接有第一個氨基酸的樹脂放入反應(yīng)瓶中，加入300 g/L哌啶/DMF溶液50 mL反應(yīng)15 min，以脫去芴甲氧羰基（FMOC）保護基團. 取2.

5、0 mmol的保護氨基酸，用1 mol/L DIEA/DMF 5 mL溶解，加入4.0 mmol的TBTU和4.0 mmol的HOBT（DMF為溶劑），預(yù)反應(yīng)1520 min，然后和氨基酸樹脂一起反應(yīng)2 h，吹去反應(yīng)液，50 mL DMF沖洗3次，吹干. 將已合成好全部氨基酸序列的樹脂放入裂解容器中. 按照TFA水955（V/V）的比例配制切割試劑，使用時按25 mL切割試劑與1 g樹脂反應(yīng)的比例進行切割，反應(yīng)時間為2 h. 將反應(yīng)液快速倒入150 mL乙醚中，收集沉淀，所用乙醚需預(yù)先放在低溫冰箱中冷卻. 將沉淀重新加蒸餾水溶解，再轉(zhuǎn)移到凍干機中凍干. 1.2.3八分支多抗原肽的合成將賴氨酸作

6、為第一個氨基酸按1.2.2的方法進行連接. 每次均脫保護15 min以上，偶聯(lián)60 min. 連接3次，得到八分支多聚賴氨酸骨架，將此支架上的賴氨酸作為合成肽的C端第一個氨基酸，按照1.2.2方法依次進行八肽的連接.     1.2.4免疫膠體金的制備參照文獻5制備成15 nm膠體金后，取100 mL用0.1 mol/L K2CO3調(diào)至pH 6.2，在攪拌狀態(tài)下加入SPA（1 g/L）0.6 mL,繼續(xù)攪拌10 min；加入50 g/L牛血清白蛋白BSA 10 mL，繼續(xù)攪拌5 min. 4， 3000 r/min離心5 min，棄沉淀，上清液以12 0

7、00 g離心15 min，棄上清，用20 mL懸浮液懸浮沉淀，以吸水纖維吸附后冷凍干燥4 h，4保存?zhèn)溆? 1.2.5免疫層析試紙條的制備試紙條由吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分組成. 吸水纖維部分附著有膠體金免疫復(fù)合物；在孔徑0.45 m硝酸纖維素膜上用多抗原分支肽和線性肽（均為5 mg/L）及1 mg/L人IgG劃線寬（1 mm），分別作為檢測線和對照線，晾干，用50 g/L BSA封閉2 h，以0.01 mol/L PBS洗滌3次，干燥后依次粘于白色塑料片上，切成0.5 cm×10 cm的試紙條，加干燥劑密封保存.     

8、;       作者：宋鵬，劉陶，楊浩，韓鋒產(chǎn)，陳五嶺【關(guān)鍵詞】人巨細胞病毒Development and primary application of immunogo         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。1.2.6抗HCMV IgG的檢測在滅菌試管中加入0.2 mL血清，將試紙條

9、含有免疫金標記物的一端插入血清內(nèi)靜置10 min. 試紙條上出現(xiàn)兩條紅色條帶為HCMV IgG陽性；僅對照線出現(xiàn)一條紅色條帶為陰性；如無紅色條帶出現(xiàn)則視為試劑失效. 血清樣本的ELISA檢測嚴格按照試劑盒說明書進行. 統(tǒng)計學(xué)處理： 對免疫層析試紙條和ELISA試劑盒檢測結(jié)果進行配對2 檢驗.2結(jié)果包被有線性肽的試紙條大部分無紅色條帶出現(xiàn)，故取消血清樣本測試. 對包被有多抗原分支肽試紙條的檢測，20份陰性及20份陽性質(zhì)控血清檢測結(jié)果符合率為100%. 隨機抽取的120份隨機血清樣本做層析試紙條檢測并和ELISA試劑盒檢測結(jié)果進行對比，顯示兩種方法在檢測結(jié)果上無顯著性差異（Tab 1）；MCHV

10、IgG檢測的靈敏度為97.9%，特異度為87.5%, ronden指數(shù)為85.4%，與ELISA試劑盒的符合率為95.8%. 表1層析試紙條的檢測結(jié)果（略）3討論包被有線性肽的試紙條在質(zhì)控血清檢測中的失敗可能是因為我們使用的硝酸素纖維膜對小分子線性多肽的固化能力弱，在洗滌過程中導(dǎo)致線性肽抗原被洗脫，造成最終試驗失敗，隨后我們用立春紅染色實驗證實了這一想法. 而人工合成的多抗原分支肽由于具有賴氨酸支架結(jié)構(gòu)，大大減少了線性肽無序聚集時形成的空間位阻，同時分子質(zhì)量較之提高了810倍，易于固化在硝酸纖維素膜上. 巨細胞病毒是一類在自然界中普遍存在但又嚴格種屬特異性的病毒，屬于皰疹病毒科. 其中使人類致

11、病的為HCMV. 它在人群中的感染非常普遍，初次感染大多在2歲以下，除少數(shù)有臨床癥狀外，通常呈隱性感染. 人感染病毒后，多數(shù)可長期帶毒成為潛伏感染6. 目前臨床診斷感染的“金標準”是細胞培養(yǎng)，但由于其耗費時間長，技術(shù)復(fù)雜，實驗室條件求高，不能達到快速檢測和基層臨床醫(yī)療機構(gòu)普及性篩查的求. 本檢測試紙條可以在20 min內(nèi)得到結(jié)果，且具有制備成本低，結(jié)果明顯易辨，操作簡便等諸多優(yōu)點，適于各級臨床醫(yī)療機構(gòu)的應(yīng)用. 【參考文獻】1 Griffiths PD, McLZean A, Emery VC, et al. Encouraging prospects for immunization agai

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13、):456-457.Jia XP. Evaluation of gold immunochromatography and ELISA assay for HBsAg detection J. Modern Med Health, 2002;18(6):456-457.4 Nejatollahi F, Samantha J, Hodgetts PJ, et al. Neutralising human recombinant antibodies to human cytomegalovirus glycoproteins gB and gH J. Immunol Med Microbiol, 2002;3:237-244.5韓鋒產(chǎn)，閆小君，候瑜，等. 膠體金免疫層析法檢測抗幽門螺桿菌細胞毒素相關(guān)蛋白A抗體J. 世界華人消化雜志，1999;7(9):743-745.Han FC,Yan XJ, Hou Y, et al. Gold immunochromatographic assay for antiHelicobacter pylori antibody J. World Chin J D