發(fā)酵過程優(yōu)化原理

1、發(fā)酵過程優(yōu)化原理第一節(jié) 發(fā)酵過程優(yōu)化的微生物反應(yīng)原理一、概述微生物是發(fā)酵工業(yè)的靈魂，對微生物控制的發(fā)酵過程進行優(yōu)化，首先要了解微生物的生長反應(yīng)特性。微生物細胞生長是細胞個體內(nèi)許多化學(xué)反應(yīng)的綜合結(jié)果。這些反應(yīng)包括合成提供其它反應(yīng)需要的吉布斯自由能；利用底物合成結(jié)構(gòu)單元，再聚合成大分子物質(zhì)，供合成細胞所需等。正常情況下，微生物細胞為了確保有序和高效生長，必須將這些反應(yīng)有機地結(jié)合在一起，經(jīng)濟地分配胞內(nèi)各代謝途徑的通量。大腸桿菌是發(fā)酵研究中用得最多的微生物。在大腸桿菌生長過程中前人已觀察到下列現(xiàn)象 (1)在大腸桿菌快速生長期間，生物合成的中間體很少滲漏到胞外培養(yǎng)基，結(jié)構(gòu)單元(氨基酸、核酸等)的合成速率

2、和聚合形成大分子的速率相一致； (2)大腸桿菌胞內(nèi)的大分子物質(zhì)隨比生長速率而變化。細胞以高的比生長速率進行生長時對蛋白質(zhì)的需求很高，因此相對于低的比生長速率來說，蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(PSS)是細胞量中較大的部分。在低比生長速率下，PSS的利用率很低，其合成和維護對微生物來說是無用的代謝負擔(dān)； (3)當(dāng)生長培養(yǎng)基中的結(jié)構(gòu)單元足夠時，細胞就不再合成這些物質(zhì)； (4)特定的代謝途徑代謝特定的底物，只有底物存在時，細胞才合成相應(yīng)的酶。如只有當(dāng)乳糖存在時，大腸桿菌才合成b-半乳糖苷酶將乳糖降解成半乳糖和葡萄糖； (5)假如兩個不同的底物同時存在于培養(yǎng)基中，細胞先合成能在一種底物上以較高比生長速率生長的酶系，

3、當(dāng)這種底物消耗完畢，再合成利用另一底物的酶。如大腸桿菌在含有葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基中生長，首先代謝葡萄糖，此生長階段不產(chǎn)生b-半乳糖苷酶，不能代謝乳糖。當(dāng)葡萄糖濃度變得很低時，系統(tǒng)合成b-半乳糖苷酶并利用乳糖繼續(xù)生長。 以上觀測結(jié)果對其它微生物也具有一定的適用性。由于微生物胞內(nèi)代謝途徑緊密結(jié)合，因此，對全部過程進行建模(如對特定微生物的生長和產(chǎn)物形成)，并不需要對所有獨立的反應(yīng)都要詳細描述。如對微生物生長建模時，通常將所有的代謝途徑混合起來用幾個單一反應(yīng)來表示，有時甚至用一個反應(yīng)式就可描述全部的生長過程。本節(jié)主要討論微生物生長反應(yīng)的基本原理。二、微生物生長反應(yīng)細胞生長過程可分為三個步驟：(1)底

4、物傳遞進入細胞；(2)通過胞內(nèi)反應(yīng)，將底物轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎|(zhì)和代謝產(chǎn)物；(3)代謝產(chǎn)物排泄進入非生物相(胞外培養(yǎng)基)。培養(yǎng)基中存在的底物都是化學(xué)物質(zhì)，可以被細胞攝入并代謝掉，或轉(zhuǎn)化為其它細胞生長所需要的物質(zhì)。有些代謝產(chǎn)物還可以作為二次底物被細胞利用，所以很難將這些物質(zhì)歸類為底物或是產(chǎn)物。例如，釀酒酵母的二次生長現(xiàn)象。當(dāng)酵母以葡萄糖為底物進行生長的同時還產(chǎn)生乙醇。葡萄糖消耗完畢，細胞可以繼續(xù)以乙醇作為底物進行生長。根據(jù)大腸桿菌生長過程中觀察到的五種情況進行類推，當(dāng)培養(yǎng)基中存在葡萄糖時，細胞不產(chǎn)生代謝乙醇的酶。因此可以觀察到，在利用葡萄糖生長和利用乙醇生長過程之間有一個滯后的階段。在本書中，只有最初存在

5、于培養(yǎng)基中的底物才被認為是底物。如上所述，葡萄糖是底物，而乙醇則是代謝產(chǎn)物。細胞質(zhì)成分是由底物形成的、不能穿過細胞膜的物質(zhì)。眾所周知的細胞質(zhì)成分有蛋白質(zhì)、RNA和DNA，而一些小分子如ATP、NADH以及NADPH也可以歸為細胞質(zhì)成分。代謝產(chǎn)物是那些形成于胞內(nèi)，能夠穿過細胞膜的物質(zhì)，它們可以被排泄進入非生物相。因此，代謝產(chǎn)物既可以是底物經(jīng)過多步反應(yīng)形成的小分子物質(zhì)，也可以是細胞產(chǎn)生的大分子物質(zhì)，如胞外蛋白酶?；谝陨系挠懻?，本書對底物、代謝產(chǎn)物和細胞質(zhì)成分的定義為：底物是一種存在于初始非生物相或者攝入物中起作用的可交換的化合物；代謝產(chǎn)物是一種作為代謝物產(chǎn)生于某代謝途徑進入非生物相的化合物；細胞

6、質(zhì)成分是一種細胞利用底物產(chǎn)生的不可交換的化合物。以下分別對運輸過程(底物的攝入和產(chǎn)物的分泌)和胞內(nèi)反應(yīng)過程進行討論。(一)運輸過程 大多數(shù)細胞的細胞質(zhì)外包圍有兩種結(jié)構(gòu)：細胞壁和細胞膜。這些結(jié)構(gòu)是細胞的屏障，其化學(xué)成分是允許非生物相和細胞質(zhì)之間物質(zhì)運輸?shù)臎Q定性因素。細胞壁是一種具有交聯(lián)肽聚糖的堅固結(jié)構(gòu)，其主要功能是為了防止因胞內(nèi)高的滲透壓而引起細胞破裂。細胞膜主要由磷脂組成，在細胞生長過程中，具有變化的流動結(jié)構(gòu)。大部分小分子很容易通過細胞壁，因此運輸過程主要決定于細胞膜。大分子物質(zhì)只有在細胞具有特定的排泄機制時才可以通過細胞壁。 革蘭氏陽性菌(如乳酸桿菌)的細胞壁約厚35 nm，要比革蘭氏陰性菌

7、(如大腸桿菌)薄2 nm左右。但是革蘭氏陰性菌具有兩層磷脂分子膜，其中一層位于細胞壁外。胞外的膜含有蛋白質(zhì)，能形成足夠大孔徑的通道，確保分子量大到800900的分子自由進出。這些充滿水的通道用于小的親水分子通過細胞膜的快速擴散，因此胞外膜就起分子篩的作用。大分子物質(zhì)只有在一些特殊的情況下，才能由專門的轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)郊毎麅?nèi)部。然而一些重要的化合物(如糖、氨基酸和多數(shù)代謝產(chǎn)物)可以自由擴散進出胞外膜，因此對于革蘭氏陰性菌來說，其細胞膜的特性決定著物質(zhì)進出細胞的運輸過程。 細胞膜由于胞內(nèi)的滲透壓而緊挨著細胞壁，但是革蘭氏陰性菌和酵母細胞的細胞膜和細胞壁之間通常還有一層，即周質(zhì)體空間。該層支持著204

8、0%的細胞質(zhì)量，含有多種蛋白質(zhì)，如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶等水解酶。在周質(zhì)體空間可發(fā)生許多反應(yīng)，這使得從胞外培養(yǎng)基到細胞質(zhì)的運輸過程變得非常復(fù)雜。周質(zhì)體空間最主要的功能就是以所謂的“結(jié)合蛋白”的形式富集底物，這可能與通過細胞膜的運輸過程存在聯(lián)系。因此，非生物相和周質(zhì)體空間的底物濃度不一定相同，在對運輸過程建模時必須考慮這些問題。 由于細胞膜是胞內(nèi)和胞外環(huán)境的重要屏障，所以在細胞膜上的運輸過程是研究者普遍關(guān)心的內(nèi)容。目前的研究表明在膜上可能存在三種不同的運輸機制：(1)自由擴散；(2)協(xié)助擴散；(3)主動運輸。前兩種機制是沿著濃度梯度進行運輸，它們是被動的過程，在運輸過程中不需要提供外部能量。而

9、主動過程逆著濃度梯度進行運輸，需要輸入相當(dāng)量的吉布斯自由能。表2-1-1總結(jié)了一些底物和代謝產(chǎn)物在細菌和真菌中的運輸過程。可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)底物在這兩種微生物中以相同的方式進行運輸。以下分別介紹三種運輸過程的特征。表2-1-1 微生物體內(nèi)不同底物和代謝產(chǎn)物的擴散過程化合物細菌真菌氨基酸葡萄糖乳糖甘油乙醇乳酸乙酸二氧化碳氧氣水主動運輸主動運輸主動運輸自由擴散，協(xié)助擴散自由擴散主動運輸和自由擴散自由擴散自由擴散自由擴散自由擴散主動運輸協(xié)助擴散和主動運輸協(xié)助擴散和主動運輸自由擴散，協(xié)助擴散自由擴散自由擴散自由擴散自由擴散自由擴散自由擴散1、自由擴散底物自由擴散通過脂膜包括三個步驟：(1)底物從胞外培養(yǎng)基

10、運輸?shù)侥は啵?2)分子在脂膜中擴散；(3)從脂相進入細胞質(zhì)。一般情況下，細胞質(zhì)具有和胞外培養(yǎng)基相似的物理和化學(xué)性質(zhì)，因此，步驟(1)和(3)相似。另外，相內(nèi)的過程可認為處于平衡，也就是說這些過程的特征時間要比分子擴散通過脂膜層的特征時間短得多。界面上脂膜層物質(zhì)的濃度可認為是水相中產(chǎn)物的濃度，分配系數(shù)Kpar就是化合物在脂層的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子擴散的質(zhì)量通量遵守Fick第一定律，化合物通過厚度為dmem的質(zhì)膜進入細胞的傳質(zhì)速率可以用方程(2-1-1)表示。(2-1-1)式中，Dmem為化合物在質(zhì)膜中的擴散系數(shù)，ca和cb分別為非生物相(胞外培養(yǎng)基)和生物相(細胞質(zhì))中化合物的濃

11、度。DmemKpar/dmem的比率又稱滲透系數(shù)P，經(jīng)常用于傳質(zhì)的計算。如果缺乏一獨特的滲透系數(shù)，可以通過式(2-1-2)進行粗略的估計。(2-1-2) 式中，Mw為化合物的分子量，為化合物在橄欖油水體系中的分配系數(shù)，P的單位為cm/s。通過大量不同化合物的測量，已經(jīng)得到了它們之間的相互關(guān)系式。然而在使用該關(guān)系式時，有些化合物的P值可能會偏離方程預(yù)測值 如果定義acell為細胞的比表面積(m2/g干細胞)，那么化合物的比運輸速率為(2-1-3)對于球形細胞來說，含水率為w(g/g)，細胞密度為r(g/m3)，則比表面積為通過自由擴散進行運輸?shù)闹匾瘜W(xué)物質(zhì)有氧氣、二氧化碳、水、有機酸和乙醇等。在

12、電離狀態(tài)下，小分子有機酸在脂膜中實際上是不溶的，此時應(yīng)當(dāng)用膜兩邊的非電離有機酸的濃度來代替方程(2-1-1)中的總濃度ca和cb，這些濃度可通過式(2-1-4)計算得到:(2-1-4)式中，Ka為酸的電離常數(shù)?？梢钥吹剑け砻嫠嗟膒H值對ci,undiss有影響，由于通常胞內(nèi)外的pH不同，盡管ca=cb，理論上一定流量的酸通過膜是有可能的。盡管有機酸能迅速達到電離平衡，同時，在水相和脂相中未電離的酸也產(chǎn)生溶解平衡，水相中靠近脂膜的地方仍然有可能存在一薄膜層。假如胞內(nèi)的酸濃度比胞外培養(yǎng)基中高得多，那么未電離的酸就持續(xù)移入脂膜，促使電離平衡向未電離形式移動，這樣多數(shù)酸就溶解在脂膜中。在膜的培養(yǎng)基

13、這邊，未電離酸的濃度很高，快速電離促使脂相中的未電離的酸進入水相。這樣，我們可以利用方程(2-1-1)模擬小分子有機酸的情況，只有當(dāng)假設(shè)的膜層不合理時，才需要修正膜內(nèi)的pH差異。為了更好地理解自由擴散的意義，讓我們來看一下乳酸的分泌過程。乳酸菌從葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岬倪^程中獲得吉布斯自由能。為了保持胞內(nèi)的pH不變，細胞必須將代謝產(chǎn)物乳酸排泄進入非生物相。乳酸的滲透系數(shù)大約為1.5×10-4cm/s。乳酸菌是直徑約為1 mm的球形細胞，含水量80%，細胞的密度106 g/m3，因此細胞的比表面積為30 m2/g干重，代入方程(2-1-3)，得到rlac=(1.5×10-6 m&#

14、215;s-1×30 m2/g干重)(ca-cb)=(4.5×10-5 m3×s-1/g干重)(ca-cb) (2-1-5)在細胞的快速生長階段，乳酸的產(chǎn)生速度大約為1.4 mg/(g干細胞×s)。由方程(2-1-5)可知，如果胞外培養(yǎng)基和細胞質(zhì)之間的濃度小至31g m-3時，擴散過程就可以將產(chǎn)生的乳酸轉(zhuǎn)移出細胞。乳酸通過脂膜的快速擴散還可以解釋多數(shù)細菌體內(nèi)乳酸(和其它小分子有機酸)的毒性效應(yīng)。胞外乳酸濃度高時，胞內(nèi)的濃度也很高。由于乳酸的電離常數(shù)很小，細胞很難維持胞內(nèi)最適pH在7左右。盡管存在乳酸的主動運輸系統(tǒng)，但通過細胞膜的快速自由擴散導(dǎo)致乳酸的連續(xù)

15、流入，隨后細胞就不再消耗排泄乳酸所需的能量。2、協(xié)助擴散細胞膜中有許多轉(zhuǎn)運蛋白，允許特定的化合物進行被動運輸，但是要比自由擴散通過細胞快得多，這一過程就是協(xié)助擴散。對于真菌來說，這種運輸機制是很典型的，在細菌中則比較少見，文獻報道中只有甘油是通過協(xié)助擴散進入大腸桿菌細胞的。協(xié)助擴散與自由擴散相似，因為只有存在濃度梯度時，才發(fā)生由高濃度向低濃度的運輸?；衔镏挥性谧杂赊D(zhuǎn)運物的存在下才能進入細胞，因此運輸過程的速率遵循典型的飽和型動力學(xué)，如在低濃度下，運輸速率與底物濃度呈一級相關(guān)，而在高濃度時則呈現(xiàn)零級相關(guān)。真菌中通過協(xié)助擴散的重要底物有葡萄糖和其它糖類。 離子可以通過細胞特定蛋白(類似于革蘭氏陰

16、性菌細胞外膜的porin)形成的孔道而被攝入。當(dāng)離子進入到孔道，內(nèi)部就形成一種電荷，這可以防止其它離子進入。因此離子孔道和轉(zhuǎn)運蛋白具有相似的功能，可以發(fā)現(xiàn)通過離子孔道的運輸也遵循飽和型動力學(xué)。 3、主動運輸 主動運輸與協(xié)助擴散的相似之處為，兩者都以特定的膜內(nèi)蛋白作為運輸過程的媒介。與協(xié)助擴散相比，主動運輸可以逆著濃度梯度的方向進行運輸，因此是一個耗能的過程。運輸過程中需要的自由能可以靠消耗ATP中的高能磷酸鍵來維持(一級主動運輸)，或者和其它沿著濃度梯度方向的運輸過程結(jié)合在一起(次級主動運輸)。對于有些底物存在一種特別的主動運輸過程，即所謂的基團移位，它是指底物在穿過細胞膜時，轉(zhuǎn)變成不可滲透的

17、異構(gòu)體。 在氧化磷酸化過程中釋放質(zhì)子就是一個重要的一級主動運輸過程。原核生物將質(zhì)子釋放到胞外培養(yǎng)基，例如穿過質(zhì)膜而泵出體外。而在真核生物中，氧化磷酸化發(fā)生在線粒體內(nèi)，質(zhì)子穿過線粒體內(nèi)膜而運輸?shù)骄€粒體內(nèi)膜和外膜之間的空間里。在這兩種情況下，質(zhì)子的泵出是通過氧化NADH而釋放大量的自由能來推動的。質(zhì)子穿過膜的排出過程中會產(chǎn)生電化學(xué)勢，將質(zhì)子運輸回細胞(或線粒體內(nèi))，就可以獲得吉布斯自由能。質(zhì)子的內(nèi)流是靠參與了ATP合成的ATP酶傳遞的。質(zhì)子的運輸是可逆的，如ATP酶也可以通過消耗ATP的方式將質(zhì)子泵出細胞，這也是一個一級主動運輸過程。質(zhì)子的運輸過程如圖2-1-1所示。圖2-1-1 質(zhì)子的運輸 次級

18、主動運輸是指在消耗已建立的其它物質(zhì)梯度的基礎(chǔ)上運輸物質(zhì)穿過細胞膜。如果這兩種底物沿著相同的方向進行運輸，過程就叫同向轉(zhuǎn)移；若兩種底物沿著相反的方向進行運輸，過程則叫反向轉(zhuǎn)移；如果電化學(xué)勢驅(qū)動離子進行運輸，則叫單向轉(zhuǎn)移。一般情況下，次級主動運輸是和穿過細胞膜的pH梯度相耦合的，為了保持胞內(nèi)pH穩(wěn)定，有必要通過ATP酶將質(zhì)子泵出細胞。由于該過程需要能量，宏觀表現(xiàn)就是次級主動運輸過程需要胞內(nèi)能量。次級主動運輸?shù)睦佑校何⑸锿ㄟ^透性酶攝入糖類。在這個過程中，糖和一個質(zhì)子結(jié)合在一起運輸?shù)郊毎|(zhì)中，即質(zhì)子同向運輸；此外還有大腸桿菌中的乳糖透性酶系統(tǒng)。研究者發(fā)現(xiàn)在乳糖質(zhì)子運輸過程中，兩種物質(zhì)的化學(xué)計量比為

19、1:1。在其它運輸過程中尚未發(fā)現(xiàn)到類似的簡單化學(xué)計量比。基團移位是主動運輸過程的一個重要方面。在該過程中，運輸過程是和被運輸?shù)孜锏牟l(fā)轉(zhuǎn)變耦合在一起。最為人熟知的基團移位的例子是磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)，一些細菌用該系統(tǒng)來攝入不同的糖類。在這個系統(tǒng)中，糖類在被運輸之前先被磷酸化，磷酸基團由EMP途徑的中間體磷酸烯醇式丙酮酸提供。至少有4種蛋白參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移(見圖2-1-2)，其中反應(yīng)鏈的最后一環(huán)同時用作運輸糖類穿過細胞膜的轉(zhuǎn)運蛋白。反應(yīng)鏈中的后兩種蛋白對于特定的糖來說是特異的，而前兩種蛋白在不同的PTSs中都是相同的。葡萄糖在PTSs運輸下進入細胞時，直接被轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖(G6P)。

20、這樣PEP中的高能磷酸鍵就得以保留，因此從能量的角度來看，這種攝入葡萄糖的過程要比通過透性酶攝入葡萄糖經(jīng)濟得多。此外，和其它的攝入系統(tǒng)相比，PTSs對糖類的攝入具有很高的速率。這可以用來解釋為什么PTSs主要存在于發(fā)酵性細菌中，其中從糖代謝生成ATP的量比呼吸性細菌少，如嚴格好氧菌Azotobacter中不含有PTSs，而厭氧菌和兼性厭氧菌如乳酸菌屬和埃希氏菌屬擁有針對幾種不同糖的PTSs。絲狀真菌和酵母也不含PTSs。圖2-1-2 某些細菌中用于攝取糖類的PTS圖解(二)胞內(nèi)反應(yīng) 底物運輸進入細胞質(zhì)后，要經(jīng)過1000多步不同的胞內(nèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)化成代謝產(chǎn)物和生物量成分，這些成分在大小和功能上存在差異

21、，但是90%以上的細胞物質(zhì)都是由蛋白質(zhì)、RNA、DNA、脂類和碳水化合物等大分子組成。大分子物質(zhì)是通過底物的合成代謝反應(yīng)而形成的，底物首先轉(zhuǎn)化為氨基酸和核酸等結(jié)構(gòu)單元，然后這些結(jié)構(gòu)單元聚合成大分子。細胞的合成代謝活力取決于培養(yǎng)基的成分，當(dāng)細胞在含有所有氨基酸的復(fù)雜培養(yǎng)基上生長，正常情況下不會再合成這些化合物。微生物的種不同，其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只含有糖、無機氮和少量無機鹽的培養(yǎng)基中生長，而有些微生物需要在含有一些結(jié)構(gòu)單元的復(fù)合培養(yǎng)基上生長。合成代謝反應(yīng)需要消耗吉布斯自由能和還原力，吉布斯自由能主要靠ATP中的高能磷酸鍵來提供，而還原力則由輔酶NADPH來提供。ATP中的高能磷

22、酸鍵水解可釋放大量的吉布斯自由能：ATPH20ADPPDG0=-30.5 kJ/摩爾(2-1-6)式中，P表示磷酸基團。G為正的反應(yīng)，可以通過水解ATP所釋放的吉布斯自由能來起動。當(dāng)NADPH被氧化成NADP+，釋放兩個電子，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)其它化合物上使其還原。ATP和NADPH是在底物轉(zhuǎn)化為能量更低的化合物的分解代謝反應(yīng)中形成的，下面即對分解代謝和合成代謝作一介紹。1、分解代謝反應(yīng)最常用于細胞生長的能源是糖類，它們在轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同時，還形成ATP、NADH和NADPH。其中NADH是和NADPH相似的一種輔酶。NADH和NADPH都在分解代謝反應(yīng)中產(chǎn)生，但NA

23、DPH主要消耗于合成代謝中，NADH則主要消耗于分解代謝途徑，如氧化磷酸化。大多數(shù)糖類在代謝之前都首先轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)。正常情況下，胞內(nèi)的G6P和F6P處于異構(gòu)平衡，G6P可以作為許多糖代謝反應(yīng)鏈的起點。有些微生物中在運輸葡萄糖的過程中形成G6P，但在另一些微生物中，G6P是通過胞內(nèi)葡萄糖與ATP水解相耦合的反應(yīng)而形成的。一般把糖從G6P開始的代謝分成酵解和丙酮酸代謝兩個部分，酵解定義為從葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸所有途徑的總和。在EMP途徑中，G6P轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從葡萄糖開始的總的計量式如方程(2-1-7)所示。Glc2ADP2P2NAD+2PYR2ATP2H2

24、O2NADH2H+=0(2-1-7)F6P轉(zhuǎn)化為1,6-二磷酸果糖的G為正，需要ATP水解提供能量才能進行。因ATP(或PEP)用于由葡萄糖形成G6P，故ATP的凈產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸時產(chǎn)生2摩爾ATP。1摩爾葡萄糖經(jīng)過部分氧化得到2摩爾丙酮酸所釋放的四個電子，被2摩爾NAD+捕獲形成2摩爾NADH。磷酸戊糖(PP)途徑的主要作用是為合成代謝提供NADPH形式的還原物和合成核酸的前體物質(zhì)5-磷酸核糖(R5P)。由于PP途徑存在分枝點，對于需要R5P和NADPH的細胞來說，存在4種可能的化學(xué)計量式(表2-1-2)。表2-1-2 4種情況下PP途徑的化學(xué)計量式情況化學(xué)計量式對R5P的需求

25、遠大于NADPH5G6P5ATP6R5P5ADP4H2O4P對R5P和NADPH的需求平衡G6P2NADP+H2OR5P2NADPH2H+CO2對NADPH的需求遠大于R5P，且G6P完全氧化為CO2G6P12NADP+7H2O12NADPH12H+6CO2P對NADPH的需求遠大于R5P，且G6P轉(zhuǎn)化為丙酮酸3G6P6NADP+5NAD+5P8ADP5PYR3CO26NADPH5NADH8ATP2H2O酵解途徑形成的丙酮酸通過乙酰CoA的形式進入三羧酸循環(huán)(TCA)，并被完全氧化生成CO2和水。這里，1摩爾丙酮酸氧化可形成1摩爾ATP，4摩爾NADH和1摩爾FADH2。丙酮酸在TCA循環(huán)中被

26、完全轉(zhuǎn)化的先決條件是，NAD+和FAD可以從NADH和FADH2中再生。該過程在呼吸鏈中發(fā)生，呼吸鏈是一個需要自由氧的氧化過程，因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸鏈中，電子從NADH通過NADH脫氫酶傳遞到輔酶UQ，再從輔酶UQ經(jīng)過一系列細胞色素(含有亞鐵血紅素基團的蛋白)，最后傳遞給氧而形成水。細胞色素或輔酶UQ存在于細胞膜上或附近(或真核細胞線粒體的內(nèi)膜)，當(dāng)電子經(jīng)過呼吸鏈，質(zhì)子就通過膜層泵出細胞。當(dāng)質(zhì)子在ATP酶的作用下再進入細胞(或線粒體)，ADP就被磷酸化形成ATP，因此呼吸鏈通常也被稱為氧化磷酸化。質(zhì)子可以通過呼吸鏈上的3個位點泵過細胞膜。根據(jù)化學(xué)計量式可知，理論上1摩爾NA

27、DH氧化可形成3摩爾ATPNADH0.5O23ADP3P3H+ NAD+3ATP4H2O(2-1-8) 對于NADPH也有相似的反應(yīng)，但是該輔酶主要用于生物合成。FADH2在UQ處進入呼吸鏈，因此電子不經(jīng)過NADH脫氫酶。FADH2的氧化只導(dǎo)致質(zhì)子在兩個位點泵過細胞膜，化學(xué)計量式和方程(2-1-8)有所區(qū)別。FADH20.5O22ADP2P2H+ FAD+2ATP3H2O(2-1-9) 每個氧原子所形成ATP的摩爾數(shù)在氧化磷酸化中，通常稱作P/O比，這個變量經(jīng)常用于能量的計算，此處不作詳細介紹。由方程(2-1-8)可以看出，如果NADH是代謝反應(yīng)形成的唯一輔酶，理論P/O比率的值即為3，但是F

28、ADH2的P/O比率通常小于3。FADH2和NADH之比會隨著操作條件而變化，因此P/O比也不是一個常數(shù)。 對于真核生物，情況可能更為復(fù)雜。NADH在細胞質(zhì)中形成(酵解)，同時線粒體中也形成NADH。細胞質(zhì)中形成的NADH不能穿過線粒體膜，它氧化為NAD+是和線粒體中FAD還原為FADH2的反應(yīng)耦聯(lián)進行的。細胞質(zhì)中NADH在和FADH2同樣的位置進入呼吸鏈，所以細胞質(zhì)NADH氧化的理論P/O值只有2。為了計算總的P/O比率，有必要將細胞質(zhì)中發(fā)生的反應(yīng)和線粒體中發(fā)生的反應(yīng)區(qū)分開來，由于這兩種情況下形成的NADH的比率隨操作條件而變化，所以通常不能指定P/O比率的值，除非知道理論值在23之間。由于

29、氧化反應(yīng)和磷酸化過程不完全耦合，所以實際的P/O比率的值與理論值不同。 當(dāng)氧化磷酸化失活(缺乏氧或必需的蛋白質(zhì))時，丙酮酸不能在TCA循環(huán)中氧化，否則將導(dǎo)致NADH在細胞內(nèi)的積累。這種情況下，NADH被氧化的同時，丙酮酸可被還原為乙酸、乳酸或乙醇。這些過程統(tǒng)稱為發(fā)酵性代謝。發(fā)酵性代謝并不是所有的微生物都一樣，但有許多共同點。圖2-1-3(a,b,c)揭示了兩種細菌和一種酵母如何通過發(fā)酵性代謝來平衡EMP途徑產(chǎn)生的還原力。如果乳酸是最終的代謝產(chǎn)物，所有EMP途徑中利用的NAD+都可以再生。當(dāng)乙醇是代謝產(chǎn)物時，就會形成NAD+過剩，不可能從葡萄糖中重新得到所有的碳，因為從碳元素的角度考慮，每摩爾葡

30、萄糖最多只能產(chǎn)生2/3摩爾乙醇，其它的碳轉(zhuǎn)化為CO2或甲酸。形成乙酸時，NADH也過剩，同樣可得出類似的結(jié)果。大腸桿菌的發(fā)酵性代謝中可形成圖2-1-3中所示的代謝產(chǎn)物，因此，這種現(xiàn)象通常又稱作混合酸發(fā)酵。大腸桿菌和乳酸菌的主要區(qū)別在于大腸桿菌缺乏在丙酮酸降解為乙酰CoA時生成CO2的能力。圖2-1-3 Escherichia(A)，Lactococci(B)和Saccharomyces(C)在葡萄糖上的發(fā)酵性代謝 酵母中丙酮酸的代謝(圖2-1-3-C)相則對復(fù)雜一些。TCA循環(huán)中化合物的代謝與合成是從乙酰CoA開始在線粒體中進行。為了使發(fā)酵代謝過程中細胞的氧化還原水平得以平衡，丙酮酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐胰?/p>

31、、乙酸和乙醇。值得注意的是，細胞質(zhì)中在乙醛氧化成乙酸時會形成NADPH。最后，乙酸可通過乙酰CoA而被代謝掉(主要通過好氧生長)。釀酒酵母則既不產(chǎn)生乙酸也不產(chǎn)生甲酸，但可攝入乳酸并轉(zhuǎn)化為丙酮酸。2、生物合成和聚合反應(yīng) 為了合成細胞物質(zhì)，需要合成結(jié)構(gòu)單元并將其聚合。E. coli細胞中大約70%的能量和還原力被用于蛋白質(zhì)的合成，微生物的種類和操作條件不同時，這一數(shù)值會發(fā)生很大變化。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，細胞對于吉布斯自由能和還原力的需求取決于培養(yǎng)基中是否存在結(jié)構(gòu)單元，因此，若細胞在只含部分結(jié)構(gòu)單元的復(fù)雜培養(yǎng)基中生長，就很難對其進行詳細的生理學(xué)研究，這也解釋了優(yōu)化培養(yǎng)基組成的困難所在。 由于合成蛋白質(zhì)

32、需要消耗大量的自由能，因此細胞能否根據(jù)其自身需求來調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成是很重要的。蛋白質(zhì)的合成是通過蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)(PSS)進行的，該系統(tǒng)中核糖體是主要部分。細胞可通過調(diào)節(jié)PSS的大小和活性來控制蛋白質(zhì)的合成，因此需要消耗能量。當(dāng)細胞從能量充足的環(huán)境到缺能的環(huán)境，12 h內(nèi)細胞就可調(diào)節(jié)PSS的大小來適應(yīng)新的環(huán)境。考慮到PSS的重要作用，有理由將它的相對大小(g/g干重)作為結(jié)構(gòu)模型中的關(guān)鍵變量。細胞合成所需要的結(jié)構(gòu)單元數(shù)在75100之間，這些物質(zhì)都是從12種前體代謝物合成得到的(表2-1-3)?？梢园l(fā)現(xiàn)，這些前體代謝物就是分解代謝反應(yīng)的中間產(chǎn)物，因此分解代謝在細胞生長過程中起著雙重的作用(為生物合

33、成提供能量和前體代謝物)。表2-1-3 合成E. coli細胞對前體代謝物的需求前體代謝物分子式摩爾質(zhì)量(g/mol)需要量(mmol/g細胞)6-磷酸-葡萄糖C6H13O9P2602056-磷酸果糖C6H13O9P260715-磷酸核糖C5H11O8P2308984-磷酸赤蘚糖C4H9O7P2003613-磷酸甘油醛C3H7O6P1701293-磷酸甘油酸C3H7O7P1861496磷酸烯醇式丙酮酸C3H5O6P168519丙酮酸C3H4O3882833乙酰輔酶A3747a-酮戊二酸C5H6O51461079琥珀酰輔酶A草酰乙酸C4H4O51321787 TCA循環(huán)的中間體用于生物合成會使T

34、CA循環(huán)活性降低，所以有必要補加這些化合物。丙酮酸羧化途徑和乙醛酸循環(huán)是最重要的兩條回補途徑。在丙酮酸羧化反應(yīng)中，草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成；在乙醛酸循環(huán)中，異檸檬酸可轉(zhuǎn)化為琥珀酸和乙醛酸，而乙醛酸可和乙酰CoA反應(yīng)生成蘋果酸。草酰乙酸和蘋果酸的生成可保證TCA循環(huán)的持續(xù)運轉(zhuǎn)。氮的同化也是細胞代謝很重要的一部分。在大多數(shù)合成培養(yǎng)基中，氨是用作氮源(氨也常作為復(fù)合培養(yǎng)基中的補充物)。氨通過結(jié)合進入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸而被同化，如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。C5H6O5(a-酮戊二酸)NH4+NADHC5H9O4N(谷氨酸)NAD+H2O(2-1-10)C5H9O

35、4N(谷氨酸)NH4+ATPC5H10O3N2ADPPH+3、次級細胞代謝 細胞代謝和生長過程偶聯(lián)在一起的過程，我們稱之為初級代謝。但許多工業(yè)上重要的產(chǎn)品，其合成反應(yīng)并不與生長過程偶聯(lián)，我們稱之為次級代謝，這些反應(yīng)合成的產(chǎn)物叫次級代謝產(chǎn)物，就象初級代謝形成的產(chǎn)物叫初級代謝產(chǎn)物一樣。次級代謝產(chǎn)物最典型的代表是抗生素。一般來說，所有細胞的初級代謝都是相似的，而次級代謝則隨細胞不同而異。定義一個代謝產(chǎn)物是初級代謝物還是次級代謝物并不麻煩，但因為所有胞內(nèi)反應(yīng)都緊密相聯(lián)，所以有時要對特定的代謝產(chǎn)物進行分類是有困難的。最早人們認為，只有與細胞生長過程中形成的才稱之為初級代謝產(chǎn)物。乳酸是初級代謝產(chǎn)物，但它是

36、乳酸菌在非生長條件下形成的，許多其它的初級代謝產(chǎn)物也同樣是在非生長條件下產(chǎn)生的，因此初級代謝產(chǎn)物定義為“在細胞生長所需要的反應(yīng)中形成的產(chǎn)物”可能比較確切一些。與之相應(yīng)，次級代謝產(chǎn)物就可定義為“在那些對于細胞生長不重要的反應(yīng)中形成的產(chǎn)物”。根據(jù)這一，胞外蛋白(由插入的基因編碼)也是代謝產(chǎn)物，但由于重組蛋白對于細胞功能不是必需的，因此不能稱之為初級代謝產(chǎn)物，應(yīng)當(dāng)將這類產(chǎn)物歸類為次級代謝產(chǎn)物。表2-1-4列出了一些重要的初級和次級代謝產(chǎn)物，其中大部分次級代謝物為抗生素。表2-1-4 一些工業(yè)上重要的初級和次級代謝產(chǎn)物一覽初級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物乳酸青霉素乙醇頭孢菌素CO2四環(huán)素乙酸鏈霉素檸檬酸短菌肽

37、谷氨酸氯霉素賴氨酸卡那霉素葡萄糖酸灰黃霉素核黃素赤霉素第二節(jié) 發(fā)酵過程數(shù)量化方法一、數(shù)量化方法的基礎(chǔ) 如果把細胞看作是一個黑箱，忽略細胞內(nèi)部的各種生化反應(yīng)，僅考慮微生物和外界的營養(yǎng)和物質(zhì)交換，可以得到深層發(fā)酵過程的宏觀模式圖，如圖2-2-1所示。一般情況下，微生物生活在液相中，營養(yǎng)物Si(包括好氧過程中的氧)和產(chǎn)物Pj、CO2及反應(yīng)熱(Hv=容積反應(yīng)熱，J/L)均通過各相及其界面?zhèn)鬟f。在發(fā)酵過程中，傳質(zhì)限制性步驟可能包括4個方面(1)氣液界面上的液膜；(2)液相主體；(3)液固界面上的液膜；(4)細胞壁和膜或固相細胞物質(zhì)。圖2-2-1 以液相中可觀察的擬均相參數(shù)來表示的發(fā)酵過程原理X生物量；S

38、i底物；O氧；Pj、產(chǎn)物；C二氧化碳；Hv容積產(chǎn)熱 發(fā)酵過程的數(shù)量化處理包括：(1)發(fā)酵過程的速度；(2)化學(xué)計量學(xué)和熱力學(xué)；(3)生產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。只有當(dāng)變量可測量時，才有可能對發(fā)酵過程進行數(shù)量化處理。因此在實踐中，要求方便、可靠和迅速地測量這些變量，特別是對發(fā)酵過程影響較大的關(guān)鍵變量進行準確測定。一般實驗條件下能夠檢測的發(fā)酵過程參數(shù)如表2-2-1所示。表2-2-1 發(fā)酵過程常規(guī)的參數(shù)及其測量符號參數(shù)測量方法X生物量細胞干重，濁度，細胞數(shù)S底物酶法分析，化學(xué)法，色譜法P產(chǎn)物酶法分析、HPLC或特殊方法X氧PO專用電極分析C二氧化碳CO專用電極分析Hv發(fā)酵熱溫度、熱平衡 對這樣一個帶有6個

39、變量的系統(tǒng)進行數(shù)量化處理，可基于帶有化學(xué)計量系數(shù)ni的方程進行：(2-2-1) 這一方程常用于好氧、并產(chǎn)生CO的分批發(fā)酵過程。當(dāng)然在有些情況下例外，如藻類生長時，利用CO2而產(chǎn)生O2。原則上講，所有發(fā)酵工藝在較寬范圍內(nèi)都是自催化反應(yīng)。這種催化由方程2-2-1表達。 對發(fā)酵過程進行數(shù)量化處理涉及很多數(shù)學(xué)符號，為便于理解，以下對本章即將出現(xiàn)的各種符號的數(shù)學(xué)含義進行解釋。(1) 比生長速率(m)、比合成速率(qp、qc或qv)和比消耗速率(qs或qo)，與消耗速率(rs或r)或形成速率(rx、rp、rc、r)的概念是不同的。前者表示細胞的個體行為，反映了細胞的生長和代謝能力，是相對速度；而后者所表示

40、的則是細胞的整體行為，是絕對速度。(2) 省略了表示一階微商的符號，用ri表示反應(yīng)的絕對速度(ri)，ni表示物質(zhì)的傳遞速度，q表示產(chǎn)熱速度。(3) Y和ni分別表示產(chǎn)率系數(shù)和化學(xué)計量系數(shù)；K專門用于表征動力學(xué)方程的平衡、飽和或抑制常數(shù)。物質(zhì)的濃度用小寫字母表示，大寫字母用于表征物質(zhì)的量(X=x×V)。(4) 反應(yīng)速度和傳遞速度的速度常數(shù)均用k來表示。帶有n級反應(yīng)的反應(yīng)速度通常為：(2-2-2A) 反應(yīng)速度常數(shù)kr取決于反應(yīng)級數(shù)。傳質(zhì)速度為：(2-2-2B)式中DC為濃度梯度。傳熱速度為：(2-2-2C) 式中DT為溫度梯度。kTR 和kHTR是表觀傳遞系數(shù)，可用真?zhèn)鬟f系數(shù)(kL1、

41、kL2、kH)和相應(yīng)的界面面積(aG/L、aL/S、aH)進一步解釋。 表2-2-2和表2-2-3對發(fā)酵過程優(yōu)化所涉及的動力學(xué)參數(shù)的概念進行了解釋。表2-2-2 發(fā)酵過程的速度概念變量動力學(xué)參數(shù)物質(zhì)傳遞熱傳遞反應(yīng)速度定義式包括單位g×L-1×h-1g×L-1×h-1kJ×L-1×h-1比反應(yīng)速率定義式包括單位h-1速度常數(shù)定義式包括表2-2-3 發(fā)酵過程的化學(xué)計量學(xué)概念概念表示方法宏觀化學(xué)計量學(xué)產(chǎn)率，包括微觀化學(xué)計量學(xué)平衡常數(shù)K，包括Km、Ks、Ki二、發(fā)酵過程的速度 以最簡單的分批發(fā)酵過程為例。當(dāng)反應(yīng)器容積VR恒定時，表2-2-1中

42、6種參數(shù)隨時間的變化曲線如圖2-2-2所示。其中可觀測的參數(shù)有：菌體(X)的生長，底物(Si和O的消耗，產(chǎn)物(Pi、CO和Hv)的積累。在研究反應(yīng)器內(nèi)部物料平衡和過程動力學(xué)時，研究者最感興趣的是這些參數(shù)變化的速度。圖2-2-2 反應(yīng)器容積恒定的分批培養(yǎng)中，發(fā)酵過程典型的濃度時間變化曲線S，底物；O，氧；X，菌體；C，二氧化碳；P，產(chǎn)物；Hv，熱。 那么，如何構(gòu)建速度方程呢?一般來說需要用質(zhì)量守恒方程來進行推導(dǎo)或解釋。這一方程主要含二項：(1)組分i被合成或消耗的來源和去向；(2)組分i通過單位表面積的物質(zhì)流nI(mol×cm-2)。物質(zhì)的流動nI=d(N/A)/dt，來自各種傳遞現(xiàn)象

43、，可用不同的術(shù)語來描述，例如流動速度v；通過濃度梯度的傳導(dǎo)，即擴散D；分散作用Deff；或界面?zhèn)鬟fkTR。 方程(2-2-3)表示濃度ci隨時間的變化。一般，方程可使用矢量符號寫成(梯度=帶方向坐標的偏微商)：(2-2-3A) 將各種傳遞項(，)分開，此方程可以以矢量的形式寫成(2-2-3B)或以單維形式(如用于管狀反應(yīng)器)寫成：(2-2-3C) 組分i形成或消耗的速度都是明顯的變量(g×L-1×h-)，形成速度為正，消耗速度為負。對于非連續(xù)的攪拌罐反應(yīng)器中物質(zhì)形成或消耗的速度，方程.c，可簡化成方程.d：(2-2-3D) 方程(2-2-3D)只有在T、VR為常數(shù)且理想混合

44、條件下才是正確的，該式僅代表一種組分形成或消耗的速度。 對于圖2-2-2中T、VR為常數(shù)且理想混合的非連續(xù)反應(yīng)器中的典型分批發(fā)酵過程，菌體生長速度為(2-2-4A) 氧和底物利用速度為和(2-2-4B) P、C和HV生成速度為，(2-2-4C)這些速度的單位是(g×L-1×h-)或(kJ×L-1×h-)，其數(shù)值可直接代入質(zhì)量平衡方程。由于這些速度是絕對速度，不能代表系統(tǒng)的特征，為了對不同生物體或不同生物反應(yīng)系統(tǒng)進行比較，需要用到物質(zhì)產(chǎn)生或利用的比速率的概念。比速率是一個相對速度，它與生物量(以細胞干重表示)或有催化活性物質(zhì)的量(如酶量)有密切的關(guān)系，一般

45、用式(2-2-5-AF)這一組方程來定義發(fā)酵過程中的各種比速率，其單位均為h-。生長的比速率為m(2-2-5-A) 或(2-2-5-B)式中n表示細胞數(shù)的比增加速率 底物消耗的比速率為qs(2-2-5-C) 對氧來說，(2-2-5-D) 產(chǎn)物形成的比速率為qp(2-2-5-E) 對CO2，(2-2-5-F)對HV，(kJ×g-×h-)(2-2-5-G) 以上比速率的定義類似于化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)中比速率的定義?；瘜W(xué)反應(yīng)動力學(xué)中非均相催化時，用活性催化劑的量MC給比速率下定義：(2-2-5-H) 均相催化時，則多使用反應(yīng)器容積VR(V)定義比速率(2-2-5-I) 在某些情況下，也

46、可用其它量，例如催化劑的外表面積或固相的體積。 方程(2-2-5-H)和(2-2-5-I)中的i代表組分i的摩爾數(shù)(ci=iV)。將其代入方程(2-2-5-I)，就可將方程(2-2-5-I)和方程(2-2-4)的定義聯(lián)系起來(2-2-5-K)當(dāng)=常數(shù)時，方程(2-2-5-K)與方程(2-2-3-D)相同。 為了完整，方程(2-2-5-I)常被用作化學(xué)動力學(xué)中反應(yīng)速度的定義。而真反應(yīng)速度r則通過化學(xué)計量系數(shù)ni同上述生長或消耗速度(ri或ri)聯(lián)系起來，(2-2-6) ni的符號遵循“消耗為負、形成為正”的原則。由于生物反應(yīng)中的化學(xué)計量系數(shù)具有不確定性，故一般難以得到方程(2-2-6)中嚴格意義

47、上的反應(yīng)速度。在進行生物反應(yīng)動力學(xué)研究時，用的最多的是方程(2-2-5-A)(2-2-5-G)給出的比消耗或比形成速率。 發(fā)酵過程的自我催化性質(zhì)可由方程(2-2-7)表示。(2-2-7)三、化學(xué)計量學(xué)和熱力學(xué)(一)化學(xué)計量方程 對發(fā)酵過程進行優(yōu)化研究，需要深入考察不同結(jié)構(gòu)反應(yīng)器中各種代謝反應(yīng)的數(shù)量關(guān)系，研究所有與獲取最大轉(zhuǎn)化率(或產(chǎn)率)相關(guān)的因素，此時需要用到元素平衡原理。平衡可以分為宏觀平衡和微觀平衡。對在反應(yīng)過程不發(fā)生改變的守恒物質(zhì)只使用宏觀平衡，而對非守恒物質(zhì)還可使用微觀平衡?；瘜W(xué)計量學(xué)是關(guān)于化合物組成和化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的數(shù)量化研究，與熱力學(xué)、動力學(xué)一起構(gòu)成反應(yīng)工程學(xué)的基礎(chǔ)。熱力學(xué)只強調(diào)系

48、統(tǒng)的起始態(tài)和終止態(tài)，能給出關(guān)于反應(yīng)可能進行到最大程度及熱釋放或吸收的信息；動力學(xué)主要涉及變化所需要的時間，可用于預(yù)測反應(yīng)的進程；化學(xué)計量學(xué)則主要研究有關(guān)加工過程中反應(yīng)組分組成的變化規(guī)律。 考慮到碳、氫、氧、氮元素的守恒，生物反應(yīng)器中微生物細胞的活動可以用化學(xué)元素的平衡方程代替方程(2-2-1)來表示：(2-2-8) 式中，是通用化了的碳源，是根據(jù)元素分析得出的細胞組成，為產(chǎn)物。在特殊情況下，元素硫和磷也可以包括進來。方程(2-2-8)是活細胞內(nèi)成百個代謝反應(yīng)綜合起來的總方程。不生成新細胞和產(chǎn)物的ATP系統(tǒng)和能量處理系統(tǒng)等代謝網(wǎng)內(nèi)的許多循環(huán)和代謝鏈，都不影響總反應(yīng)。因此，在使用總化學(xué)計量方程進行

49、宏觀處理時，并不需要了解這些循環(huán)的詳細情況，這樣可使發(fā)酵過程的分析不太復(fù)雜，而又不失去重要的信息。 在生物反應(yīng)中，原子守恒的一般形式是各反應(yīng)的總和，由下式表示：(2-2-9)式中，n為化學(xué)計量系數(shù)，g為特定的元素。 然而，由于有數(shù)百種組分參與代謝，將方程(2-2-9)直接用于生物工藝的化學(xué)計量確實存在困難，但可以只將有限的幾種化合物用在總生長化學(xué)計量方程中。理論上已證明這種方法是合理的。當(dāng)復(fù)合反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)()時，可將方程(2-2-3)同方程(2-2-6)組合起來，寫成和的形式：(2-2-10)這樣，可以通過觀察穩(wěn)態(tài)時系統(tǒng)與環(huán)境之間的交流()來研究反應(yīng)的化學(xué)計量學(xué)。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中沒有產(chǎn)物凈生成時，

50、有許多量被稱為守恒量。這時的平衡方程沒有產(chǎn)物生成項。 (2-2-11) 在穩(wěn)態(tài)情況下，上述論據(jù)證實了可根據(jù)生長和產(chǎn)物形成的總化學(xué)計量方程來對微生物代謝進行處理。除了非開放反應(yīng)器系統(tǒng)的定量化之外，把化學(xué)計量學(xué)用于發(fā)酵過程的主要問題來自代謝反應(yīng)是個復(fù)雜的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。對于簡單反應(yīng)，化學(xué)計量學(xué)價值不大；而要處理復(fù)雜反應(yīng)，只能借助于用于復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)的數(shù)學(xué)方法。在這種情況下，必須建立元素平衡方程。由于這種方法太復(fù)雜，人們首先在生物工藝的定量化中使用了一種簡單得多的方法使用產(chǎn)率系數(shù)的概念。(二)產(chǎn)率系數(shù)的概念 宏觀產(chǎn)率系數(shù)(或稱得率系數(shù))Yi/j是化學(xué)計量學(xué)中一種非常重要的參數(shù)，常用于對碳源等底物形成菌體或產(chǎn)

51、物的潛力進行評價，其中i表示菌體或產(chǎn)物，j表示底物。Yi/j最初是由onod以質(zhì)量單位和商的形式定義的：= (2-2-12) 根據(jù)這一定義，可以將消耗的量同形成的量關(guān)聯(lián)起來，定量表示細胞或產(chǎn)物甚至熱量的產(chǎn)率。產(chǎn)率的概念同樣也能用于定量地表示不同消耗量之間或形成量之間的相互關(guān)系。表2-2-4對產(chǎn)率系數(shù)的定義進行了總結(jié)。表中質(zhì)量組分的單位為(g組分i/g組分j)，有熱量時的單位為(kJ/g組分j)。表2-2-4 生物反應(yīng)過程中宏觀產(chǎn)率系數(shù)的定義總覽產(chǎn)率系數(shù)組分間的反應(yīng)或關(guān)系定義YX/SSXYX/S=-rX/rSYX/OO2XYX/O=-rX/rOYP/SSPYP/S=-rP/rSYC/SSCO2Y

52、C/S= -rC/rSYP/OO2PYP/O= -rP/rOYHv/SSHvYHv/S=-rHv/rsYC/OO2CO2YC/O=-rC/rOYHv/OO2HvYHv/O=-rHv/rO 在某些情況下，以摩爾為單位表示產(chǎn)率系數(shù)更有利：(2-2-13) 異化過程中生成每摩爾ATP時增加的菌體質(zhì)量，即對ATP生成的菌體產(chǎn)率YATP是研究生化途徑分子能量學(xué)時的重要參數(shù)。微生物通過氧化底物，獲得菌體合成、物質(zhì)代謝、物質(zhì)傳遞等生命活動所需的能量，但只有氧化反應(yīng)中以生成ATP的形式獲得的自由能，才能被微生物所利用，其余能量作為代謝反應(yīng)熱釋放到環(huán)境中。根據(jù)這一觀點，Bauchop以異化代謝中ATP的生長兩作

53、為菌體產(chǎn)率的基準，定義(2-2-14)式中Ms為底物的分子量，YATP/S為相對于能源底物消耗的ATP產(chǎn)率，即每消耗1摩爾能源底物生成ATP的摩爾數(shù)。計算YATP，需要知道作為能源的底物的準確消耗量。在復(fù)合培養(yǎng)基上進行的厭氧培養(yǎng)，若培養(yǎng)基中所有碳源幾乎都作為能源被分解，不轉(zhuǎn)化為菌體成分，且只限于在底物分解過程中生成ATP時，ATP的生成、利用與菌體合成之間的關(guān)系如圖2-2-3所示。圖2-2-3 復(fù)合培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)過程中細胞的生物合成步驟及ATP的生成和利用YATP與微生物及底物種類無關(guān)，基本為一常數(shù)。在復(fù)合培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)實驗中觀察到，不管微生物和環(huán)境的性質(zhì)如何，YATP總是約為10.5。但該

54、值對微生物生長具有普遍性。在基本培養(yǎng)基中無論是厭氧還是需氧培養(yǎng)，單一碳源中一部分作為能源通過異化代謝分解，其余部分用于同化構(gòu)成菌體。假設(shè)用于同化的這部分碳源與ATP生成無關(guān)，則對于異化代謝的碳源亦服從YATP10。 把相似的概念用于重要的常數(shù)和，可表達為(2-2-15)(2-2-16)值在實踐中對推導(dǎo)元素平衡方程很重要，對與氧化磷酸化有關(guān)的理論問題也有重要意義。碳摩爾的概念可使產(chǎn)率以摩爾為單位來表達(2-2-17) 根據(jù)(2-2-17)的定義，可表示除了碳源和氧以外的底物的細胞產(chǎn)率。(三)產(chǎn)率系數(shù)與化學(xué)計量系數(shù)的關(guān)系 在方程(2-2-8)給出的通用化學(xué)計量方程的基礎(chǔ)上，每種主要元素(C、H、O、N，省略S、P和灰分)都可寫成下列平衡方程摩爾C(2-2-18-A)摩爾H(2-2-18-B)摩爾O(2-2-18-C)摩爾N(2-2-18-D)在方程(2-2-18-AD)中，生成碳摩爾細胞的底物()和NH3()的量可以直接測出。通過元素分析能測定細胞和產(chǎn)物的組成，得出a、b、g、d和a