兒茶素對(duì)56腎切除大鼠腎臟微血管的保護(hù)作用及其機(jī)制

1、兒茶素對(duì)5/6腎切除大鼠腎臟微血管的保護(hù)作用及其機(jī)制         09-08-13 11:19:00     編輯：studa20                        作者：曹艷, 何小解, 向偉, 易著文【摘要】  目的：探

2、討兒茶素對(duì)5/6腎切除大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinconverting enzyme, ACE）、血管緊張素（angiotensin , Ang ）及腎臟組織微血管密度（microvessel density, MVD）的影響。方法：60只SD大鼠被分為假手術(shù)組、模型組和兒茶素組。模型組和兒茶素組大鼠切除5/6腎臟制作模型，假手術(shù)組不做腎切除。兒茶素治療8周與12周后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34標(biāo)記的腎局部微血管數(shù)并計(jì)算密度；紫外分光光度法檢測(cè)血漿與腎皮質(zhì)中ACE活性；放射免疫法測(cè)定血漿與腎皮質(zhì)中Ang 濃度；蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，HE）

3、染色及過碘酸希夫（periodic acidSchiff, PAS）染色后，半定量積分法評(píng)價(jià)腎小球硬化指數(shù)(glomerular sclerosis index, GSI)與腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(tubule interstitial score, TIS)。結(jié)果：兒茶素組GSI與TIS在第8、12周末均顯著低于模型組（P<0.05，P<0.01）；模型組和兒茶素組腎小球及小管周圍MVD在第8周與第12周末較假手術(shù)組均明顯降低（P<0.01）；兒茶素組血漿、腎皮質(zhì)中ACE活性與Ang 濃度在實(shí)驗(yàn)第8與第12周末均顯著低于模型組（P<0.01）；Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，

4、MVD與GSI、TIS、ACE、Ang 呈負(fù)相關(guān)（P<0.01），ACE、Ang 與GSI、TIS呈正相關(guān)（P<0.01）。 結(jié)論：兒茶素可有效阻止5/6腎切除大鼠腎臟微血管密度的減少，抑制腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展，這可能與兒茶素抑制ACE的活性，減少Ang 的生成有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  兒茶素; 微血管密度; 血管緊張素; 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶; 大鼠    Objective: To investigate the effects of catechin on angiotensinconverting enzyme (ACE) acti

5、vity, angiotensin (Ang ) content and microvessel density (MVD) in renal tissues of 5/6 nephrectomized rats.    Methods: Sixty SD rats were divided into 3 groups: shamoperated group, untreated group and catechin group. Animal model was reproduced by 5/6 nephrectomy. After 8 and 12week

6、administration, rats were sacrificed. Renal MVD was measured by immunohistochemical method with CD34 marking. Activities of ACE in plasma and renal cortices were measured by ultraviolet spectrophotometer, and Ang contents in plasma and renal cortices were measured by radioimmunoassay. Glomerular scl

7、erosis index (GSI) and tubule interstitial score (TIS) were calculated by semiquantitative integration with hematoxylin and eosin staining and periodic acidSchiff staining.    Results: After 8 and 12week administration, the GSI and TIS in the catechin group were much less than those i

8、n the untreated group (P<0.05, P<0.01). MVDs around glomerulus and tubule at the end of the 8th and 12th week in the untreated group and the catechin group were much less than those in the shamoperated group (P<0.01). The ACE activities and Ang contents in plasma and renal cortices in the c

9、atechin group were much less than those in the untreated group (P<0.01). By Pearson correlation analysis, we found that MVD had negative correlation with GSI, TIS, Ang content, and ACE activity(P<0.01), however, the ACE activity and Ang content had positive correlation with GSI, TIS (P<0.01

10、).    Conclusion: Catechin can prevent the 5/6 nephrectomized rats from decreasing of MVD and inhibit the progress of glomerular sclerosis and interstitial fibrosis by inhibiting the activity of ACE and reducing the production of Ang .    Keywords: catechin; microvessel

11、 density; angiotensin ; angiotensinconverting enzyme; rats    腎臟微血管不僅是炎癥、代謝等損害因素的承受者，也是腎臟損傷的直接參與者,維持腎臟微血管功能與數(shù)目對(duì)于預(yù)防腎臟病變持續(xù)性進(jìn)展有重要意義1, 2。腎臟微血管包括腎小球毛細(xì)血管（glomerular capillary, GC）和腎小管周圍毛細(xì)血管（peritubular capillary,PTC），除維持腎臟的正常結(jié)構(gòu)和功能外，在慢性腎臟疾病進(jìn)展中，腎臟微血管的減少程度與腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化程度呈正比，微血管進(jìn)行性減少是引起腎功能惡化的一個(gè)

12、重要因素3。血管緊張素（angiotensin , Ang ）是激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶的最主要刺激因子。還原型NADPH氧化酶的激活是活性氧自由基的主要來源，這些活性氧可以引起血管內(nèi)皮功能障礙，細(xì)胞增殖，血管壁中膜肥厚、纖維化及出現(xiàn)炎癥，也可通過腎素血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system, RAS）及Ang 的型受體（angiotensin receptor , AT1)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）的降解，參與

13、腎小球硬化和間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展4。兒茶素是一種強(qiáng)效的非酶抗氧化劑，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素可通過改善血液流變學(xué)而降低尿蛋白的排泄與腎臟病理損傷程度5。Yang等6發(fā)現(xiàn)兒茶素在體外抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensinconverting enzyme, ACE）活性。但兒茶素能否通過降低Ang 的生成，降低腎臟微血管的丟失，延緩腎病理慢性進(jìn)展，目前尚未見報(bào)道。本研究擬利用5/6腎切除大鼠模型，探討兒茶素對(duì)5/6腎切除模型大鼠ACE、Ang 及腎局部微血管密度（microvessel density, MVD）的影響及可能機(jī)制，為臨床腎臟病防治提供新的理論依據(jù)。  

14、  1  材料與方法    1.1  主要藥品與試劑  兒茶素（購(gòu)自湖南金農(nóng)生物科技有限公司），ACE活性測(cè)定試劑盒（購(gòu)自海軍總醫(yī)院），Ang 放射免疫測(cè)定試劑盒（購(gòu)自中國(guó)原子能研究所），CD34單克隆抗體（購(gòu)自Santa Cruz公司），免疫組織化學(xué)PowerVision二步法試劑盒（購(gòu)自北京中杉生物工程有限公司）。    1.2  實(shí)驗(yàn)方法    1.2.1  5/6腎切除模型制備及分組  60只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量18020

15、0 g，由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，許可證號(hào)為SYXK(湘)20040013。模型制作參照文獻(xiàn)方法7，40只大鼠作5/6腎切除，采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分為模型組（n=20）和兒茶素組（n=20）。假手術(shù)組（n=20）行10%水合氯醛麻醉（3 mL/kg），暴露并剝離腎包膜，不作腎切除。模型制備后3 d，兒茶素組大鼠予400 mg/(kg·d)兒茶素（50 g/L）灌胃5，1次/d；模型組與假手術(shù)組給等量生理鹽水灌胃。大鼠根據(jù)分組分別灌胃8周或12周。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，所有大鼠均被飼養(yǎng)在12 h明、12 h暗，室溫為2328 ，相對(duì)濕度50%70%的環(huán)境中，食用全

16、價(jià)顆粒飼料（由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）。另取5只大鼠同時(shí)制備5/6腎切除模型作為鑒定與備用。在模型制備完成后第1周和第4周，各殺1只大鼠按文獻(xiàn)方法7鑒定模型是否制備成功。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中模型組和兒茶素組大鼠僅在行單腎2/3切除時(shí)各死亡1只，并立即以備用鼠進(jìn)行了補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)大鼠分別于治療8周后和12周后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，留取血液標(biāo)本與腎組織備用。    1.2.2  腎臟病理檢查  各組大鼠處死后，取左側(cè)殘余腎，10%中性甲醛固定24 h后石蠟包埋。切片23 m，行蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色及過

17、碘酸希夫（periodic acidSchiff, PAS）染色，采用Raij等8半定量方法評(píng)估腎小球硬化程度，計(jì)算腎小球硬化指數(shù)（glomerular sclerosis index, GSI）。每張切片至少觀察40個(gè)腎小球，根據(jù)腎小球硬化灶所占腎小球比例分為5個(gè)等級(jí)。0級(jí)：基本正常；1級(jí)：腎小球硬化面積1%25%；2級(jí)：硬化面積26%50%；3級(jí)：硬化面積51%75%；4級(jí)：硬化面積達(dá)到76%100%。計(jì)算公式為(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/腎小球總數(shù)。式中N1代表1級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù)，N4為4級(jí)損害腎小球個(gè)數(shù)。采用Radford等9半定

18、量方法評(píng)估腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)（tubule interstitial score, TIS）。按皮質(zhì)區(qū)腎間質(zhì)纖維化程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度、腎小管擴(kuò)張或萎縮程度分級(jí)。損傷程度分為6級(jí)。0級(jí)為正常；1級(jí)為病變范圍<10%；2級(jí)為病變范圍10%24%；3級(jí)為病變范圍25%50%；4級(jí)為病變范圍51%75%；5級(jí)為病變范圍>75%。計(jì)算公式為(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4+5×N5)/觀察的皮質(zhì)區(qū)視野數(shù)。式中N1為1級(jí)病變皮質(zhì)區(qū)視野數(shù)，N5為5級(jí)病變皮質(zhì)區(qū)視野數(shù)。每張切片至少觀察40個(gè)皮質(zhì)區(qū)視野，計(jì)算TIS。  

19、;  1.2.3  血漿ACE活性與Ang 含量的測(cè)定  ACE是一種可以從底物馬尿酸組氨酰亮氨酸（HipHisLeu簡(jiǎn)稱HHL）的C末端專一水解二肽的酶，HHL被ACE從C末端水解去除一肽HisLeu后，生成馬尿酸。ACE活性使用分光光度法測(cè)定的馬尿酸生成量來計(jì)算，具體參考試劑盒說明書。Ang 測(cè)定采用放射免疫測(cè)定法，計(jì)數(shù)儀為SN682型，標(biāo)準(zhǔn)曲線由不同量Ang 標(biāo)準(zhǔn)品用放射免疫藥盒測(cè)定獲得。    1.2.4  腎皮質(zhì)中ACE活性與Ang 含量的測(cè)定  迅速取出腎臟，去除周圍結(jié)締組織，稱取質(zhì)量后放入4 組織提取

20、液20 mL中迅速勻漿，勻漿在4 5 000×g離心20 min，取上清直接測(cè)ACE活性。Ang 需提純后再進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下，將上述上清液過柱，固相提取氮?dú)獯蹈?，采用高壓液相色譜法（high pressure liquid chromatography, HPLC）分離，干燥物用0.25 mL流動(dòng)相液溶解，進(jìn)入Gilson HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分離，乙腈和七氟丁酸比例為5545，分別由雙泵泵入，流速為0.8 mL/min，柱溫2425 。C18柱（DiamonsilTM，250 mm×4.6 mm i.d.，5 m），進(jìn)樣環(huán)500 L，檢測(cè)池紫外波長(zhǎng)215 nm，進(jìn)樣20

21、0 L，收集Ang 峰，大約1.2 mL流出液可使Ang 收集完全。為避免樣品與標(biāo)準(zhǔn)品間污染，每次進(jìn)樣后均需用洗脫液將柱及進(jìn)樣環(huán)沖洗干凈，再用流動(dòng)相平衡后進(jìn)下一個(gè)樣品。收集的Ang 流出液干燥后用放射免疫測(cè)定法（radioimmunoassay, RIA）檢測(cè)Ang 濃度。    1.2.5  腎臟MVD的測(cè)定  按免疫組織化學(xué)PowerVision二步法試劑盒提供方法測(cè)定CD34，胞膜陽性為MVD。一抗為兔抗大鼠CD34單克隆抗體，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。觀察者對(duì)每個(gè)標(biāo)本單盲法隨機(jī)觀察20個(gè)間質(zhì)視野計(jì)數(shù)CD34陽性的毛細(xì)血管腔個(gè)數(shù)，

22、得出腎小管周圍毛細(xì)血管（peritubular capillary, PTC）密度10，單位為個(gè)/mm2；每個(gè)標(biāo)本查看20個(gè)腎小球橫切面，計(jì)數(shù)CD34陽性的毛細(xì)血管腔個(gè)數(shù)，并取平均值，得腎小球毛細(xì)血管密度11，即CD34陽性毛細(xì)血管腔個(gè)數(shù)/腎小球橫切面，單位為個(gè)/mm2。    1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。多組資料間和同組多個(gè)時(shí)點(diǎn)資料間比較時(shí)，方差齊者，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；方差不齊者，采用Tamhane分析。相關(guān)關(guān)系應(yīng)

23、用Pearson相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。    2  結(jié)  果    2.1  各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)  實(shí)驗(yàn)第8周末，腎組織HE染色和PAS顯示，假手術(shù)組腎臟病理大致正常，模型組與兒茶素組大鼠殘余腎組織表現(xiàn)為腎小球肥大，毛細(xì)血管襻擴(kuò)張，伴系膜組織增生，出現(xiàn)不同程度局灶節(jié)段腎小球硬化，毛細(xì)血管襻塌陷及球囊粘連。實(shí)驗(yàn)第12周末，模型組大鼠出現(xiàn)明顯腎間質(zhì)纖維化與腎小球硬化(見圖1)。兒茶素組GSI與TIS在第8周和第12周末均顯著低于模型組（P<0.01，P<0.05）。無論是兒茶素組還是模型組，GSI與TIS在第8周均顯著低于第12周（P<0.01，P<0.05）。見表1。    2.2  各組大鼠腎臟MVD  第8周與第12周末，假手術(shù)組腎小球毛細(xì)血管均開放良好，腎小管周圍毛細(xì)血管排列分布及形態(tài)均正常。模型組與兒茶素組則出現(xiàn)程度不一的腎小球毛細(xì)血管腔擴(kuò)張，毛細(xì)血管塌陷、閉塞及硬化，腎小管周圍毛細(xì)血管局灶性病變，毛細(xì)血管腔縮小