western blot實(shí)驗(yàn)步驟

1、western-blot實(shí)驗(yàn)步驟Western bolt一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)了解 western blot 技術(shù)的原理和操作。二、實(shí)驗(yàn)原理SDS-PAGE 是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式,特別是用于蛋白質(zhì)純度 檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。PAGE 能有效的分離蛋白質(zhì)，主要依據(jù)其分子量和電 荷的差異,而 SDS-PAG 的分離原理則僅根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量的差異。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基 硫酸鈉），SDS 會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS 的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS 多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的

2、遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽 可與 1.4g 去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在 15KD 到 200KD 之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和 分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX 式中：MW 為分子量，X 為 遷移率，k、b 均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù) 作圖， 可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線， 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳， 根據(jù)它的電 泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，簡(jiǎn)稱(chēng) NC 膜），在膠體金試紙中用做 C/T 線的承載體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處。 NC 膜是生物學(xué)試

3、驗(yàn) 中最重要的耗材之一。第一抗體就是能和特異性抗原特異性結(jié)合的蛋白。 第二抗體是能和抗體結(jié) 合， 即抗體的抗體，其主要作用是檢測(cè)抗體的存在，放大一抗的信號(hào)?；瘜W(xué)發(fā)光 HRP 底物（辣根過(guò)氧化物酶底物，也常被稱(chēng)為 ECL 試劑）是目 前 Western blot 檢測(cè)中最為靈敏的試劑。顯影液的 A 液主要成分為魯米諾（Luminol ）及發(fā)光增強(qiáng)劑，B 液主要成分為過(guò)氧化物溶液。二抗上含有 HRP（辣根過(guò)氧化物酶） ，可以催化 A 液和 B 液反應(yīng)發(fā)光。三、實(shí)驗(yàn)器材1. 電泳槽，膠板架子2. 轉(zhuǎn)膜儀3. NC 膜4. 電泳電源5. 濾紙6 搖床7. X 射線攝影暗匣8. X 射線膠片9. 塑料薄

4、膜四、實(shí)驗(yàn)試劑1.r unnin gbuffer 5xrunnin gbuffer(IL) Tris15.1g1.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1.1SDS-PAGE膠的配置1先清洗膠板，用去離子水沖洗后放在架子上待干。2準(zhǔn)備好試劑。3計(jì)算所需要使用試劑的量。例：6%的分離膠，每塊膠板分離膠約需要 7ml，10 塊膠，共需要 70ml4將膠板安裝在架子上，較低的板朝外，注意底部要平，以防漏膠。較高的板 有正反之分，上面的“ up”朝上。5準(zhǔn)備配膠按照上面配方依次添加。 注意：1.添加量少的試劑要注意混勻2.TEMED ，APS 要最后力卩6配好分離膠，將膠液注入膠板縫隙中。注意速度不能太慢，否則膠

5、液會(huì)凝， 越是濃度咼的膠液凝的越快。7分離膠加入后，用異丙醇或水封平膠面，注意在加入異丙醇或水的時(shí)候要緩Glyc ine SDS ddH2O 使用前稀釋2.Tra nsfer buffer 10XTran sfer buffer(1L) TrisGlyc ine ddH2O 使用前稀釋3.TBS 10XTBS(500mL)Tris Nacl ddH2O94.0g5.0g定容至 1L30.3g144.0g定容至 1L加入 1/4 體積的甲醇10 倍,12.1g40.0g定容至 500mL pH值至 7.6用 HCI 調(diào)節(jié)溶液的4.TBST(1L)1XTBS:Twee n-20=1000:1 dd

6、H2O 定容至 1L 5.5%的脫脂奶粉溶液(50ml) 脫脂奶粉2.5gTBST6. 一抗溶液7. 二抗溶液8. 顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用，溶液 A:溶液 B=1:1 配置。9.SDS-PAGE(配方見(jiàn)下一頁(yè))五、操作步驟定容至 50ml慢不要過(guò)分沖擊膠，否則容易導(dǎo)致分離膠的液面兩邊凹陷或不平整。8半小時(shí)后觀察分離膠是否凝結(jié)，左右輕輕傾斜膠板看是否有出現(xiàn)膠面晃動(dòng)。 凝結(jié)后，將異丙醇或水到掉，將架子倒置去除多余的異丙醇或水。9配置濃縮膠，同配置分離膠相似，配方不同。配好后倒膠。每塊膠用約 注意不要到過(guò)多的濃縮膠，以防插梳子后膠會(huì)溢出，倒置在之后用膠前拔梳子 的時(shí)候出現(xiàn)上揚(yáng)孔破損現(xiàn)象。且倒膠后應(yīng)盡快插梳子

7、，注意梳子有正反。A.分離膠6%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.853.994.565.740%Acr/bis0.751.051.21.51.5Mtris-HCl（pH8.8）1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0040.00560.00640.0088%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.63.644.165.240%Acr/bis11.41.621.5Mtris-H 1.31.822.082.63ml。Cl(pH8.8)10%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)

8、硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0030.00420.00480.00610%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.353.293.764.740%Acr/bis1.251.7522.51.5Mtris-HCl(pH8.8)1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00412%GEL5ml7ml8ml10mlH2O2.12.943.363.340%Acr/bi1.52.12.44.0s1.5Mtris-HCl(pH8.8)1.31.822.08

9、2.510%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.00415%GEL5ml7ml8ml10mlH2O1.7252.4152.763.4540%Acr/bis1.8752.62533.751.5Mtris-HCl(pH8.8)1.31.822.082.610%SDS0.050.070.080.110%AP（過(guò)硫酸銨）0.050.070.080.1TEMED0.0020.00280.00320.004B.濃縮膠5%GEL2.02ml4.04ml6ml10mlH2O1.482.964.443.440%A

10、cr/bis0.250.500.750.831.0Mtris-HCl（pH6.8）0.250.500.750.6310%SDS0.020.040.060.0510%AP（過(guò)硫酸銨）0.020.040.060.05TEMED0.0020.0040.0060.0051.2凝膠電泳1將電泳槽和膠板架子用去離子水清洗干凈，把事先準(zhǔn)備好的膠板和電泳槽與膠板架子組裝好。注意：膠板較短的一側(cè)朝內(nèi)。2往電泳槽內(nèi)注入 running buffer，如果膠板架子和膠板組裝的不是很?chē)?yán)密需要 將 runningbuffer 加超過(guò)上樣孔，但也不要漫過(guò)膠板最上方。3根據(jù)自己需求上樣。4蓋上電泳槽的蓋子，注意電極的正負(fù)。

11、插上電源，打開(kāi)電源，設(shè)置時(shí)間和電壓。一般需要設(shè)置兩次時(shí)間，濃縮膠100V, 0.5h;分離膠要根據(jù)分離膠的濃度和實(shí)驗(yàn)的需求而定。分離膠濃度越低，蛋白樣跑的越快。5開(kāi)始電泳。2.轉(zhuǎn)膜（半干轉(zhuǎn)）1轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備 2 張比分離膠部分略大的濾紙和 1 張與濾紙相同大小的 NC膜。切濾紙和膜時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜。在轉(zhuǎn)膜前要將NC膜先放在去離子水中浸泡幾分鐘，因?yàn)橹苯訉C 膜泡在 Transferring buffer中會(huì)導(dǎo)致 NC 膜變的很皺。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里， 要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。 若膜沉入水里，膜與水之

12、間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜吸水。）2在加有 Transferring buffer 的搪瓷盤(pán)里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、一支試管、濾 紙和浸過(guò)的膜。3將轉(zhuǎn)膜儀打開(kāi)，在上面墊浸泡過(guò)的濾紙，用試管取一些 Transferring buffer輕輕倒在上面，再用試管來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。4在濾紙上擺放好 NC 膜,注意膜的中間先與濾紙接觸，然后兩邊慢慢放下。5將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時(shí)候動(dòng)作要輕，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會(huì)兒玻璃板便開(kāi)始松動(dòng)，直到撬去玻板。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。 記住正反面，切去一角已標(biāo)記方向

13、。6小心剝下分離膠去離子水中清洗掉上面的廢膠，后用手拿著膠的輕輕置于 NC 膜上，注意膠的中間要先與 NC 膜接觸，然后慢慢放下，以防有氣泡。用手調(diào)整 使其與 NC 膜對(duì)齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。7在最上面鋪上最后一層濾紙。8用紙吸取多余的 Transferring buffer 。9蓋上轉(zhuǎn)膜儀的蓋子，插上電源，打開(kāi)電源，設(shè)置時(shí)間和電壓，25V, 45min。3.免疫反應(yīng)1. 取出 NC 膜于，用剪刀減去多余的 NC 膜部分， 記正反。將 NC 膜置于 TBS 中在搖床上搖 3 次，2. 封閉：加入 5%的脫脂奶粉溶液，1h，倒去。3. 抗（1: 10000）孵育 4C過(guò)夜。4. 取出 NC 膜，用 TBST 在搖床上洗三次，每次5. 圭寸閉：加入 5%的脫脂奶粉溶液，1h，倒去。6 用同樣的方法，二抗（1: 10000）孵育，1h。7.取出 NC 膜，用 TBST 洗三次，每次 15min。4.顯影取兩張塑料膜，剪成比膜大的相同的大小。將其中一張鋪在X 射線攝影暗匣 里。2按照 1: 1 配制好顯影液，混勻。3將 NC 膜平鋪在第一張塑料膜上，將顯影液均勻的鋪在 NC 膜上,左右搖晃 X 射 線攝影暗匣使顯影液盡量鋪滿(mǎn) NC 膜。4將第二張塑料膜從左到右或從上到下鋪在最上面，用膠布粘住四邊固定。蓋 好夾子。5在暗室里，打開(kāi)夾子，取四張 X 射線膠片將其小心蓋