基于復(fù)合納米材料-離子液體的新型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研制并用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)1

1、基于復(fù)合納米材料-離子液體的新型乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研制并用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)的綜述1 引言目前食品安全是全社會(huì)廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)問題。近幾年，雖然國(guó)內(nèi)外不斷加大對(duì)食品安全監(jiān)管的力度，但“從農(nóng)田到餐桌”的食品產(chǎn)業(yè)鏈條依然危機(jī)四伏，不斷通過(guò)各種媒體進(jìn)入公眾視野的如“瘦肉精”豬肉中毒事件、“劣質(zhì)奶粉事件”、“蘇丹紅事件”、“多寶魚”、“二噁英”、“農(nóng)藥殘留”等事件，使民眾對(duì)食品安全憂心忡忡。 在原料農(nóng)、牧產(chǎn)品的生產(chǎn)中，大量不合理的使用獸藥、化肥、激素，使農(nóng)業(yè)及農(nóng)村環(huán)境污染日益加劇，大量有毒有害物質(zhì)附著沉淀在農(nóng)（畜）產(chǎn)品中，如水果、蔬菜中的有機(jī)磷、有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留，在草莓、番茄、香蕉、西瓜等農(nóng)產(chǎn)品中

2、使用催熟劑，糧食作物中鉛、鎘等重金屬污染，豬肉中瘦肉精、禁用獸藥等的殘留都會(huì)引起慢性、急性食物中毒，食品安全從原料開始，便受到嚴(yán)重的威脅。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖業(yè)中，不法業(yè)主為了提高水產(chǎn)品的成活率和出品率，不惜使用禁用魚藥，甚至使用激素類藥物，有些藥物代謝速度非常慢，因此大量殘留在成品中，嚴(yán)重威脅著人民群眾的身體健康。在食品安全檢測(cè)中，農(nóng)藥殘留量已經(jīng)成為重要的檢測(cè)指標(biāo)。農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)是保證食品安全的重要支撐。時(shí)代的發(fā)展對(duì)食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)的靈敏度要求越來(lái)越高，檢測(cè)范圍也在擴(kuò)大。農(nóng)藥殘留檢測(cè)不僅要檢測(cè)農(nóng)藥的目標(biāo)物，還要對(duì)其毒性比較大的代謝物進(jìn)行檢測(cè)。這無(wú)疑對(duì)食品農(nóng)藥殘留的檢測(cè)提出了更高的要求。現(xiàn)在常

3、用的檢測(cè)手段有色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和波譜法1,2，這些方法雖然選擇性和靈敏度較好，但儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴、操作繁瑣、使用成本高、難以在現(xiàn)場(chǎng)使用，因而普及困難。因此，迫切需要研究和開發(fā)一些快速、方便、可靠的食品安全檢測(cè)技術(shù)。生物傳感器分析技術(shù)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，它作為一種檢測(cè)手段已在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛的研究與應(yīng)用。生物傳感器3的應(yīng)用大大縮短了農(nóng)藥殘留的檢測(cè)所用的時(shí)間， 而且基于電化學(xué)方法的生物傳感器， 為儀器的小型化、智能化提供了可能。電化學(xué)生物傳感器的原理如圖1所示，其構(gòu)成包括兩部分：生物敏感膜和換能器。被分析物擴(kuò)散進(jìn)入固定

4、化生物敏感膜層，經(jīng)分子識(shí)別，發(fā)生生物學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的信息繼而被相應(yīng)的化學(xué)換能器或物理?yè)Q能器轉(zhuǎn)變成可定量和可處理的電信號(hào)，再經(jīng)二次儀表（檢測(cè)放大器）放大并輸出，便可知道待測(cè)物濃度4,5。圖1：電化學(xué)生物傳感器示意圖電化學(xué)生物傳感器根據(jù)生物分子識(shí)別元件上的敏感物質(zhì)可分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器、免疫傳感器、DNA 傳感器及組織傳感器等。而基于酶的電化學(xué)生物傳感器主要有電壓型6、電流型7和電壓電流型三類。所用的酶類主要有水解酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶等，進(jìn)而形成了單酶型 (膽堿酯酶或水解酶)和雙酶型 (膽堿酯酶與膽堿氧化酶)的電化學(xué)生物傳感器。近年來(lái)，基于特定酶活性的抑制原理設(shè)計(jì)的酶生物

5、傳感器(EBS)在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方面受到極大的關(guān)注，例如乙酰膽堿酯酶生物傳感器在農(nóng)藥殘留方面的檢測(cè)。乙酰膽堿酯酶(AChE，也稱真膽堿酯酶)，廣泛存在于動(dòng)物的組織、血液、昆蟲組織及植物中。早在30多年前，就有AChE提取方法的報(bào)道。由于昆蟲飼養(yǎng)容易且繁殖周期短，因此昆蟲的乙酰膽堿酯酶8,9的提取倍受青睞。多以昆蟲幼蟲為材料分離純化乙酰膽堿酯酶。目前，主要有兩種提取乙酰膽堿酯酶的方法：一種是硫酸銨和丙酮沉淀法；另一種是凝膠過(guò)濾層析法(Sephadex G-100和G-200兩種)。現(xiàn)在市場(chǎng)上使用的酶主要是從敏感家蠅頭部提取純化的乙酰膽堿酯酶10,11 。膽堿酯酶電流型傳感器的工作原理12,13：

6、底物氯化乙酰硫代膽堿酯酶在催化作用下水解為乙酸和巰基膽堿，巰基膽堿是具有電活性的物質(zhì)，在外加一定電勢(shì)的前提下，可在pt、玻璃等基礎(chǔ)電極表面氧化，產(chǎn)生的氧化電流強(qiáng)度可反映出它的電極表面的濃度。當(dāng)膽堿酯酶被農(nóng)藥抑制時(shí)，氧化電流的大小能準(zhǔn)確的反映出酶被抑制的程度，從而檢測(cè)出農(nóng)藥殘留的濃度。CH3-CO-O(CH3)2-NCl(CH3)3CH3-COOH+HO-(CH2)2- NCl(CH3)3 (1) Enz-Ser-OH+R-O-PO-(OCH3)2Enz-Ser- O-PO-(OCH3)2+R-OH (2) 水解檢測(cè)氯化硫代乙酰膽堿水解電流并按下式計(jì)算AChE的百分抑制率：A=(I0-I)/I0

7、 ×100A：酶的百分抑制率（與農(nóng)藥殘留具有正相關(guān)性）I0：未被有機(jī)磷抑制的酶電極穩(wěn)定響應(yīng)電流（空白電流）I：指被有機(jī)磷抑制后酶電極的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流2 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展2.1 乙酰膽堿酯酶的固定化2.1.1 吸附法吸附法是通過(guò)載體表面和酶分子表面間的次級(jí)鍵相互作用而達(dá)到固定目的的方法。只需將酶液與具有活潑表面的吸附劑接觸，再經(jīng)洗滌除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最簡(jiǎn)單的固定化技術(shù)，在經(jīng)濟(jì)上也最具有吸引力。該方法操作簡(jiǎn)便，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。但酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制14。吸附法分為物理吸附法和離子吸附法。物理吸附法常用

8、的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。離子吸附法常用的交換劑有CM-纖維素、DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；其他離子交換劑還有各種合成的樹脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。Takeshi Shimomura等15研制了雜交介孔膜固定酶檢測(cè)乙酰膽堿的電流型生物傳感器。AChE和膽堿氧化酶固定于孔隙直徑為12nm的雜交介孔二氧化硅膜上。測(cè)量連續(xù)的酶反應(yīng)產(chǎn)生的過(guò)氧化氫，檢測(cè)范圍為 6.0800M，反應(yīng)時(shí)間約3 min。與自由酶相比穩(wěn)定性好，在保存80天后還有80%酶活性。還研究了通過(guò)對(duì)AChE的抑制檢測(cè)Ops殺蟲劑。Zheny

9、u Wang等16研究了通過(guò)不同的納米粒子吸附和抑制AChE。在有蛋白質(zhì)和酶的情況下，通過(guò)反應(yīng)會(huì)引起人造納米粒子的中毒。AChE是存在于大腦、血液和神經(jīng)系統(tǒng)中主要的酶，因此，通過(guò)SiO2，TiO2，Al2O3，Al，Cu，CuC，MWCNT和SWCNT八種納米粒子吸附和抑制AChE。修飾埃爾曼試驗(yàn)測(cè)定AChE活性，因?yàn)榧{米粒子能吸附顏色變化的微黃色產(chǎn)物，5-巰基-2-對(duì)硝基苯甲酸 (5-MNBA)。通過(guò)AChE活性的減少評(píng)價(jià)納米粒子的吸附和抑制速率。SWCNT對(duì)AChE的吸附可達(dá)94%，納米SiO2和Al2O3吸附最低。然而，有Cu和CuC納米粒子釋放的Cu2+ 能使AChE的活性分別減少40

10、%和45%。通過(guò)這些試驗(yàn)AChE用于納米粒子的生物標(biāo)記有很大的潛力。2.1.2 共價(jià)結(jié)合法共價(jià)結(jié)合（偶聯(lián)）法是目前研究中最活躍的方法。它的原理是酶蛋白分子上的功能基團(tuán)和固相支持物表面上的反應(yīng)基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，因而將酶固定在支持物上。共價(jià)偶聯(lián)法得到的固定化酶結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。但是載體活化的操作復(fù)雜，反應(yīng)條件激烈，需要嚴(yán)格控制條件才可以獲得較高活力的固定化酶。共價(jià)鍵結(jié)合法所采用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。Ivaylo Marinov 等17將聚合丙烯腈膜和金納米粒子（GNPs）制成膜孔固定AChE，用1-甲基-3-碳亞胺

11、氫氯化物通過(guò)共價(jià)鍵的方法固定酶到納米管薄膜上。最佳固定條件為：酶溶液；4 C下固定15h，同時(shí)檢測(cè)了固定酶的生物化學(xué)特性和動(dòng)力學(xué)參數(shù)。Wei Zhu等18報(bào)道了一種新的微透析-電化學(xué)裝置同時(shí)檢測(cè)用N-甲基-（R）-豬毛菜酚處理的鼠腦中的乙酰膽堿和膽堿，研制了聚合物（m-(1,3)-苯二胺）（pmPD）和聚酪胺固定酶的電化學(xué)生物傳感器。這種生物傳感器的應(yīng)用能更好的理解帕金森疾病的發(fā)病機(jī)理。Ravi Sinha 等19研制了基于氧化鋅溶膠-凝膠的AChE生物傳感器用于殺蟲劑的檢測(cè)。研究了用氧化鋅做基質(zhì)固定AChE的電流型生物傳感器檢測(cè)殺蟲劑對(duì)氧磷，對(duì)氧磷在，可以通過(guò)對(duì)AChE的抑制檢測(cè)有機(jī)磷殺蟲劑

12、。固定的酶的活性在，4 C下能保持三個(gè)月。Subramanian Viswanathan 等20報(bào)道了聚苯胺沉積到ssDNA包埋垂直組裝的碳納米管修飾AChE電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)殺蟲劑。 通過(guò)殺蟲劑對(duì)酶的抑制分別檢測(cè)常用于蔬菜的兩種Ops殺蟲劑甲基對(duì)硫磷和毒死蜱，檢測(cè)范圍在1.0×1011-1.0×106M (0.6 < SD< 3.5)時(shí)傳感器有很好的再生能力和穩(wěn)定性。這種傳感器同樣可用于檢測(cè)水樣中的甲基對(duì)硫磷和毒死蜱。WenJing Chen等21報(bào)道了用毛細(xì)管柱法固定蛋白質(zhì)的進(jìn)展。在絲狀二氧化硅毛細(xì)管柱中固定蛋白質(zhì)（酶），已經(jīng)在手性分離、定位肽、藥物篩

13、選、預(yù)富集等方面得到重要的應(yīng)用。該文報(bào)道了固定蛋白質(zhì)于毛細(xì)管柱的幾種方法，包括溶膠-凝膠法、物理吸附法、離子螯合吸附法、基本的液體蛋白質(zhì)的固定和共價(jià)鍵法。 交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，可以長(zhǎng)時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來(lái)不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長(zhǎng)補(bǔ)短。O. Stoilova等22報(bào)道了苯乙烯

14、-馬來(lái)樹脂酐共聚物的功能性電紡絲膜固定AChE。AChE在戊二醛做交聯(lián)劑以共價(jià)鍵的方式固定于修飾膜上，并測(cè)定了固定蛋白的用量和AChE的活性，被修飾的AChE顯示出很高的活性。固定酶的濃度為，pH為7，用體積比為10戊二醛做交聯(lián)劑。Tamara Lazarevi Pati等23用戊二醛做交聯(lián)將AChE固定在有活性的約束性氣孔玻璃上。張璐等24應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)法將巴西日?qǐng)A線蟲乙酰膽堿酯酶固定于多壁碳納米管修飾的玻璃電極表面，制備了電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。Ovidiu Ilie Covaci等25報(bào)道了優(yōu)化硝基苯胺重鹽固定AChE于微電極用于靈敏檢測(cè)Ops殺蟲劑。本研究?jī)?yōu)化了用對(duì)硝基苯胺重

15、鹽修飾AChE鉑金微電極。首先，對(duì)硝基苯基在電極表面沉淀然后分解；最后用戊二醛將酶交聯(lián)在氨基上。每一步制備的修飾電極都用CV和電化學(xué)交流阻抗光譜測(cè)定電極特性，中性pH修飾不同組分在電極上的變化。通過(guò)電位法、電流法和CV測(cè)試重鹽組分，只有電位法在表面沒有鈍化現(xiàn)象。使用微電極改進(jìn)了檢測(cè)乙基對(duì)氧磷的檢測(cè)限與絲網(wǎng)印刷電極相比檢測(cè)限從100nM降到20nM。這種方法建構(gòu)的電流型微生物傳感器穩(wěn)定、可再生，并適用于其他酶和電極材料。Michele Del Carlo等26報(bào)道了用普魯士藍(lán)修飾的絲網(wǎng)印刷電極獲得膽堿氧化酶生物傳感器檢測(cè)蜂蜜中的香豆磷。用戊二醛做交聯(lián)劑，通過(guò)交聯(lián)的方法固定膽堿氧化酶到PB-SPE

16、的表面。Xia Sun等27研制了基于普魯士蘭修飾乙酰膽堿酯酶生物傳感器用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留。這種傳感器有雙模（殼聚糖膜和普魯士藍(lán)膜）修飾玻碳電極，殼聚糖28膜通過(guò)戊二醛交聯(lián)劑固定AChE，提高了識(shí)別殺蟲劑的選擇性。普魯士藍(lán)膜電沉積在GCE表面加快電子轉(zhuǎn)移。2.1.4 包埋法包埋法是將游離酶包埋于格子或微膠囊內(nèi)，格子的結(jié)構(gòu)可以防止酶滲出到周圍的培養(yǎng)基中，而底物分子仍能滲入格子內(nèi)與酶接觸。包埋類型可有：網(wǎng)格型、微囊型及脂質(zhì)體液膜型。包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，酶的空間結(jié)構(gòu)很少改變，酶活性的回收率較高，可用于許多酶的固定化。但此法只適用于小分子反應(yīng)的底物或產(chǎn)物，這樣才可以通

17、過(guò)高分子聚合物進(jìn)行擴(kuò)散。Dan Du29報(bào)道了基于碳納米管有微膠囊包著的多吡咯和聚苯胺共聚物的電流型AChE生物傳感器監(jiān)測(cè)OPs。合成的Pan-PPy-MWTNTs共聚物具有很好的滲透性和相同的形態(tài)，能理想的包埋酶分子。Georges Istamboulie等30用物理包埋法固定AChE和PTE于乙烯感光樹脂聚合物（AWP）中, AWP和酶的比例70:30 (v/v)。漩渦混勻混合液，并短時(shí)的離心消除泡沫。用微量注射器吸取3L混合液均勻滴在工作電極表面，在4 C的氖光下疊氮化合物中光聚3h，然后4 C下干燥48h。研制的AChE和PTE復(fù)酶生物傳感器能有效的區(qū)別毒死蜱和毒蟲畏的抑制作用。等31

18、研制了低成本集成電路片中制成人造神經(jīng)網(wǎng)（ANNs）研制出絲網(wǎng)印刷酶?jìng)鞲衅饔糜跈z測(cè)殺蟲劑。用包埋法固定酶于光敏聚合物（AWP）乙烯醇上, AWP和酶溶液的比例為 70:30% (v/v)。用數(shù)字信號(hào)微控器完成人造神經(jīng)網(wǎng)設(shè)備，從而研制電流型AChE生物傳感器用于殺蟲劑混合物的分析。用數(shù)字信號(hào)微控器完成兩個(gè)ANNs對(duì)不同濃度的氧毒死蜱和毒死蜱在三個(gè)傳感器上的反應(yīng)，得到較好的預(yù)測(cè)結(jié)果，已成為低成本分析化學(xué)檢測(cè)的專業(yè)方法。Dan Dua等32報(bào)道了固定AChE于-環(huán)式糊精于多壁碳納米管修飾玻碳電極，這種高靈敏性的電流型生物傳感器用于OPs殺蟲劑的經(jīng)檢測(cè)。通過(guò)聚合包埋法合成的復(fù)合材料的特性用傅立葉變換紅外

19、光譜(ATR-FTIR)和掃描電子顯微鏡表征(SEM)。由于-環(huán)式糊精于多壁碳納米管復(fù)合材料好的可分散性和滲透能力，為建構(gòu)AChE生物傳感器提供了適宜的微環(huán)境，并能保持AChE的生物活性用于檢測(cè)OPs。MWCNTs在低電壓時(shí)能促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)和促進(jìn)硫代膽堿電催化氧化，因此能提高檢測(cè)的靈敏性?；贠Ps對(duì)AChE活性的抑制，檢測(cè)樂果樣品，樂果抑制的濃度比例范圍是和2.44-10.00M,檢測(cè)限為2 nM (S/N = 3)。這種傳感器可再生性和穩(wěn)定性強(qiáng)，為分析酶的抑制提供了新的方法。B. Ebrahimi等33報(bào)道了響應(yīng)面分析法優(yōu)化和評(píng)價(jià)用陶瓷包埋法固定AChE本方法用溶膠-凝膠-多壁碳納米管復(fù)

20、合材料支撐陶瓷圓管固定AChE，響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)和分析固定反應(yīng)，二次數(shù)學(xué)方程式預(yù)測(cè)酶的活性。優(yōu)化參數(shù)后的結(jié)果顯示出固定AChE于溶膠-凝膠-多壁碳納米管復(fù)合材料的活性高于用溶膠-凝膠或石墨溶膠-凝膠固定。并且，這種系統(tǒng)有高的穩(wěn)定性和可再生能力，分別在30，40，50min檢測(cè)得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.88%，2.11%和2.13%。 膽酶?jìng)鞲衅鞯碾姌O材料2.2.1 納米碳Liu G等34通過(guò)一層一層的靜電自組裝AChE到多壁碳納米管上修飾玻碳電極。Yavor Ivanov等35研制了通過(guò)親和力作用固定專一位點(diǎn)的AChE到多壁碳納米管聚合膜的電流型生物傳感器，這種傳感器用于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，對(duì)樣品

21、溶液中對(duì)硫磷的檢測(cè)限為×1012gl1。2.1.2 金納米粒子Ivaylo Marinov等36制備了包溶金納米粒子的納米聚合膜的乙酰膽堿酯酶安培計(jì)型硫代乙酰膽傳感器，這種傳感器對(duì)對(duì)氧磷的檢測(cè)限為7.39×1011 gl1。LI Yan- Rong等37固定乙酰膽堿酯酶到一維金納米粒子上，研制了用于檢測(cè)有機(jī)磷殺蟲劑的傳感器。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)甲胺磷的檢測(cè)范圍-1。Dan Du等38報(bào)道了基于碲化鎘量子點(diǎn)(CdTe QDs )/金納米粒子有殼聚糖微球體修飾的AChE生物傳感器。CdTe QDs和GNPs結(jié)合提高了電子轉(zhuǎn)移，促進(jìn)了硫代膽堿的電催化氧化，因此對(duì)酶作用物有很高的親

22、和力和敏感性，可快速方便的檢測(cè)久效磷。 納米復(fù)合材料Dan Du等39報(bào)道了一步合成碳納米管-金納米復(fù)合材料構(gòu)建電流型AChE生物傳感器。合成的MWCNTs-Au納米復(fù)合材料為吸著生物分子提供了極易親水的表面，制備了穩(wěn)定的AChE生物傳感器。該傳感器能對(duì)Ops做出簡(jiǎn)單而有效的生物監(jiān)測(cè)，以馬拉息昂為樣品，抑制比濃度范圍是和2-15g/ml，檢測(cè)限為。Alina C Ion等40研制了基于碳納米管-殼聚糖復(fù)合材料的乙酰膽堿酯酶伏安生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷殺蟲劑。因?yàn)榧{米材料增大了表面積和傳導(dǎo)性，AChE對(duì)硫代乙酰膽堿（ATCl）的親和力提高，快速反應(yīng)形成了硫代膽堿。這種傳感器對(duì)ATCl濃度的響應(yīng)曲線分

23、為兩段，一段為，另一段為，檢測(cè)限為1.58×1010M。Jingming Gong等41用一步電沉積方法構(gòu)建了三維有孔鈣碳酸鹽-殼聚糖復(fù)合膜固定AChE的生物傳感器檢測(cè)殺蟲劑。用這種復(fù)合膜作為固定酶的基質(zhì)，得到高靈敏性和穩(wěn)定性的AChE傳感器檢測(cè)甲基對(duì)硫磷，抑制甲基對(duì)硫磷的濃度比例范圍從到-1，檢測(cè)限為1ngml-1。Du D42等報(bào)道了碳納米管和金合成納米復(fù)合材料或結(jié)合殼聚糖構(gòu)建AChE生物傳感器。Jingming Gong等43報(bào)道了用金-多吡咯網(wǎng)狀復(fù)合納米材料固定AChE修飾玻碳電極的生物傳感器檢測(cè)甲基對(duì)硫磷殺蟲劑。這種網(wǎng)狀納米材料不僅提供了用于保持AChE生物活性的生物微環(huán)境

24、，而且對(duì)檢測(cè)有機(jī)磷顯示出強(qiáng)大的協(xié)同效應(yīng)。金納米粒子(AuNPs)和多吡咯納米線（PPyNWs）的結(jié)合促進(jìn)酶的氧化產(chǎn)生硫代膽堿，增強(qiáng)了檢測(cè)的靈敏性，對(duì)甲基對(duì)硫磷的檢測(cè)限為-1。Yunhe Qu等44制備了層-層自組裝AChE/樹狀大分子聚酰胺-Au納米粒子到碳納米管上的修飾電極檢測(cè)殺蟲劑。電極上的碳納米管為固定AChE提供了適宜的環(huán)境，修飾的膜提高了電催化活性和膜與電極表面的電子轉(zhuǎn)移速度。對(duì)蟲螨威的響應(yīng)線性范圍是×10-9M-0.9×10-7M，檢測(cè)限為4.0×10-9M。2.1.4 離子液體離子液體45是一種新型的有機(jī)溶劑，是在室溫或室溫附近溫度下呈液態(tài)的由離子構(gòu)

25、成的物質(zhì)，典型的離子液體是由有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子構(gòu)成的。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑和電解質(zhì)相比，離子液體具有一系列突出的優(yōu)點(diǎn)，例如幾乎無(wú)蒸汽壓，無(wú)可燃性，對(duì)有機(jī)、無(wú)機(jī)和有機(jī)金屬化合物有極好的溶解能力，液程寬，熱穩(wěn)定性高46。離子液體的無(wú)味、無(wú)惡臭、無(wú)污染、不易燃、易與產(chǎn)物分離、易回收、可反復(fù)多次循環(huán)使用、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)揮發(fā)性溶劑的理想替代品，它有效地避免了傳統(tǒng)有機(jī)溶劑的使用所造成嚴(yán)重的環(huán)境、健康、安全以及設(shè)備腐蝕等問題，為名副其實(shí)的、環(huán)境友好的綠色溶劑。由于離子液體具有導(dǎo)電性、難揮發(fā)、不燃燒、電化學(xué)穩(wěn)定電位窗口比其它電解質(zhì)水溶液大很多等特點(diǎn)，因此，離子液體已廣泛用于電化學(xué)的研究。Luci

26、an Rotariu等47研究了在碳納米管-離子液體(CNT-IL)凝膠傳感器上低壓硫代膽堿的氧化作用。比較了八種硫代膽堿傳感器的循環(huán)伏安和電流特性，得出在36-45A/mMcm2時(shí)選擇使用凝膠修飾的碳納米管-離子液體傳感器對(duì)檢測(cè)AChE有很好的靈敏性，已被用于檢測(cè)農(nóng)藥殘留。Muhammad Moniruzzaman等48對(duì)離子液體中酶反應(yīng)的研究進(jìn)展做了綜述?？偨Y(jié)了酶在離子液體中的反應(yīng)活性、固定酶的方法、酶的穩(wěn)定性等。 溶膠-凝膠絲網(wǎng)印刷電極材料Andreescu 等49,50采用了聚合體和溶膠- 凝膠材料將AChE固定在絲網(wǎng)印刷電極上。高慧麗等51采用溶膠- 凝膠材料，將AChE固定在醋酸纖

27、維膜上，檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。Michael Waibel 等52采用溶膠- 凝膠材料將乙酰膽堿酯酶固定在絲網(wǎng)印刷電極制備了農(nóng)藥殘留生物傳感器檢測(cè)對(duì)氧磷的檢測(cè)限為1g/L，檢測(cè)對(duì)硫磷的檢測(cè)限10g/L。Hanane Zejli等53建立了基于AChE的氧化鋁溶膠-凝膠/超聲凝膠-碳電極檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥，溫育10min，對(duì)氧甲基毒死蜱的檢測(cè)限為2.5×10-10M。Georges Istamboulie等54用絲網(wǎng)印刷聚合物（3,4-乙撐二氧噻吩）（PEDOT）作為電化學(xué)介質(zhì)用于AChE生物傳感器，這種電極介質(zhì)與傳統(tǒng)的電極介質(zhì)相比顯示出高的傳導(dǎo)率，用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中的氧化毒死蜱。2.3

28、 水果蔬菜中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè) 周祖新等55以尼龍網(wǎng)為載體，采用共價(jià)鍵法固定酶，研制了乙酰膽堿酯生物傳感器用于水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。張君等56制備了用于水果蔬菜中檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的高靈敏絲網(wǎng)印刷酶電極，采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)在PVC 板材上分步套印制出三電極， 然后在工作電極上通過(guò)分子交聯(lián)和Nafion 膜協(xié)同固定乙酰膽堿酯酶的新思路來(lái)制備的單酶型電化學(xué)生物傳感器。 邱朝坤等57對(duì)酶抑制法快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留進(jìn)行研究。以鯽魚腦、肝臟和肌肉乙酰膽堿酯酶(AChE)為檢測(cè)用酶，對(duì)白菜、青椒、西紅柿、豆角、空心菜中的敵敵畏、辛硫磷和毒死蜱有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留進(jìn)行檢測(cè)。藍(lán)炎陽(yáng)等58研究了直接測(cè)定殘

29、留農(nóng)藥對(duì)乙酰堿酯酶的抑制率高低顯示農(nóng)藥殘留毒性水平 ，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，適用于水果中有機(jī)磷和氨暴甲酸酯類等農(nóng)殘的快速檢測(cè)。Josiane Caetano等59報(bào)道了通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶的活性檢測(cè)西紅柿中甲萘胺的安培計(jì)型生物傳感器。Dan Du等60報(bào)道了基于多吡咯和聚苯胺共聚物上參雜多壁碳納米管的乙酰膽堿酯酶電流型生物傳感器檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留。這種傳感器有很好的穩(wěn)定性和再生能力，對(duì)有機(jī)磷的檢測(cè)限為1.0 ng/mL。Huanshun Yin等61報(bào)道了將乙酰膽堿酯酶固定在金納米粒子和蠶絲蛋白上修飾鉑電極的電流型生物傳感器，用于檢測(cè)甲基對(duì)氧磷、蟲螨威和辛硫磷。蠶絲蛋白為酶分子提

30、供了適宜的生物環(huán)境，穩(wěn)定了生物活性，并且有效的阻止了酶從鉑電極表面脫落。硫代乙酰膽氯化物起氧化作用，金納米粒子能在電壓較低時(shí)促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移作用和促進(jìn)硫代膽堿的電化學(xué)氧化作用，從而提高了檢測(cè)的靈敏性。這種傳感器對(duì)甲基對(duì)氧磷、蟲螨威和辛硫磷的檢測(cè)限分別為2×10-11M、1×10-10M、2×10-9M。2.4 水中的有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的檢測(cè) Alhareda62等用乙酰膽堿酯酶直接檢測(cè)自來(lái)水和果汁樣品中的對(duì)氧磷和敵百威。孟范平等63將乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)傳感器與流動(dòng)注射系統(tǒng)(flow injection analysis sy

31、stem，F(xiàn)IA)相結(jié)合。通過(guò)光學(xué)方法測(cè)定固定化酶受農(nóng)藥抑制后的殘余活性，對(duì)海水中微量甲基對(duì)硫磷進(jìn)行定量分析。在01100gL之間，農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)值與固定化酶活性的抑制率之間具有良好的線性關(guān)系(r=0995 3)。利用該系統(tǒng)檢測(cè)含甲基對(duì)硫磷分別為08 gL和50 L的模擬海水樣品，獲得了較好的準(zhǔn)確度和精密度，平均相對(duì)誤差和變異系數(shù)均小于1O。Lu Zhang等64應(yīng)用化學(xué)交聯(lián)法將巴西日?qǐng)A線蟲乙酰膽堿酯酶(AChE)固定于多壁碳納米管修飾的玻碳電極表面，制備用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)的電化學(xué)生物傳感器。測(cè)定了湖水中馬拉硫磷的含量，回收率為97%105%。響應(yīng)電流與馬拉硫磷的濃度在6. 0 ×1

32、0 - 10 6. 0 ×10 - 9 mol·L - 1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.0 ×10- 10 mol·L1。陳向強(qiáng)等65采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)制作厚膜型電極， 通過(guò)交聯(lián)法將乙酰膽堿酯酶固定在電極上， 開發(fā)快速檢測(cè)水中有機(jī)磷農(nóng)藥的酶?jìng)鞲衅鳌?在交聯(lián)固定酶的情況下， 根據(jù)酶活受到有機(jī)磷抑制的原理， 采用時(shí)間-電流法對(duì)特丁硫磷和對(duì)硫磷進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明:這兩種有機(jī)磷的檢測(cè)限都可以達(dá)到1 ng/ mL。3 發(fā)展趨勢(shì)因?yàn)榧{米顆粒具有表面效應(yīng)、尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，與常規(guī)表面活性材料相比表面活性位置增加，吸附點(diǎn)位置增多，因而增加了化學(xué)

33、反應(yīng)的接觸面和催化能力，可以作為優(yōu)良的電極材料。而離子液體具有熔點(diǎn)低、穩(wěn)定性高、溶解能力強(qiáng)、導(dǎo)電性高、蒸汽壓低電勢(shì)窗寬等普通有機(jī)溶劑和水而不具備的獨(dú)特性質(zhì)，已被廣泛的應(yīng)用于電化學(xué)領(lǐng)域。此外，離子液體還具有良好的生物相容性，是一些生物分子電催化過(guò)程中的理想介質(zhì)。因而納米粒子與離子液體復(fù)合材料能進(jìn)一步改善和提高傳感器的性能，如可提高生物催化活性，加快電子轉(zhuǎn)移和具有協(xié)同催化作用等。合成功能化的離子液體和納米材料有效的結(jié)合，改善傳感器的整體性能。提高AChE檢測(cè)的靈敏度，使之更方便快捷的檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥。優(yōu)化電極結(jié)構(gòu)，尋求AChE在電極表面固定的新方法；納米粒子與離子液體復(fù)合材料復(fù)合成分的選擇、復(fù)合物制

34、備方法，從而獲得優(yōu)良性能的復(fù)合物，進(jìn)而提高傳感器的靈敏度、選擇性、穩(wěn)定性、電催化活性及生物兼容性。參考文獻(xiàn)1 Qiuhua Wu, Xin Zhou ,Yuemin Li, Application of dispersive liquid-liquid microextraction combined with high-performance liquid chromatography to the determination of carbamate pesticides in water samplesJ. Anal Bioanal Chem (2009) 393:17551761.2

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