Western blot 操作步驟

1、Western-blot- 操作步驟實驗原理:Western blot操作步驟Wester n blotWestern blot抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過 PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如P VDF膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。內(nèi)參:WB過程監(jiān)測以及目的蛋白定量的標(biāo)準(zhǔn)；最重要和最不可或缺的對照就是內(nèi)參照。1.內(nèi)參可檢

2、測整個 WB實驗過程及體系是否正常工作，如果一個實驗連內(nèi)參照都岀不了陽性結(jié)果的話（在內(nèi)參抗體有效的情況下），那么這個體系就是存在問題的;2、起半定量的標(biāo)準(zhǔn)的作用，內(nèi)參一般選擇管家基因編碼表達(dá)的蛋白，在很多組織和細(xì)胞中都是穩(wěn)定表達(dá)的，因此可以作為檢測靶蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn);，也稱 Western blotting、蛋白印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。內(nèi)參名稱分子量大小適用范圍采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE ），被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是GAPDH30-40kDa胞漿和全細(xì)胞Tubulin55kDa胞漿和全細(xì)胞VCDA1/Pori n31kDa線粒體COXIV16kDa線粒體TB

3、P38kDa細(xì)胞核實驗步驟、蛋白樣品制備（組織中總蛋白的提?。┑谝徊?法（1敲取0.07-0.1g 組織+400-500UI裂解液，放入打樣管，放入打樣機(jī)打樣。法（2）實驗室研缽研磨：取稍大于0.1g的樣品放入研缽中，加少量液氮凍硬，用研杵來回研磨至粉末狀，用槍頭刮取收集入離心管。注：任何操作都要在液氮中進(jìn)行，并且要將槍頭和離心管提前泡在液氮中。第二步:取岀的樣品放置冰上1-2h （中間混勻5-6次）直至裂解完全。第三步:樣品離心 X 2，取上清于新的 EP管中。（離心條件:13000rpm , 4 C, 30min )注：離心機(jī)提前預(yù)冷至 4 Co二、蛋白含量的測定第一步：在96孔板第一列1

4、-8分別為濃度為0, 1 , 2, 4, 6, 8,9，10倍的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液+水=10或20ml，再加上5倍稀釋的考馬斯亮藍(lán)染液200ml。第二步：在96孔板后面幾列依次加入稀釋的蛋白樣品或原液10-20ml以及5倍稀釋的考馬斯亮藍(lán)染液200ml。注：原液濃度太高時進(jìn)行稀釋，用裂解液稀釋。三、電泳第一步：清洗玻璃板將玻璃板在蒸餾水下沖洗干凈，去除雜質(zhì)，再用去離子水清洗一遍，自然晾干。第二步：配膠(1)玻璃板對齊后放入夾中卡緊，然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。3/4位置時即可。(2)配分離膠，加入 TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板然后膠上加一層水，液封后的膠凝固更快。注：加水液封時須緩慢

5、，否則膠會被沖變形。(3)當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝固。倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。配濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠，然后將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔岀。注：插梳子時要使梳子保持水平，兩邊對齊垂直插入。(4)用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。)第三步：上樣(1)測完蛋白含量后，計算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入15 X Loading Buffer 于離心管，100 C水中煮 5min使

6、蛋白變性。放置冰上 3min，離心15min， 13000rpm，4C。(2)加足夠的1 X電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。(電泳液至少要沒過內(nèi)測的小玻璃板。)用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸岀不要吸進(jìn)氣泡。 將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣 品。(加樣太快可使樣品沖岀加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢岀。)第四步：電泳濃縮膠80V電壓跑20分鐘，至蛋白 marker分離即可加壓，也可多跑幾分鐘；分離膠 120V電壓跑至底端。第五步：停止電泳純水沖洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標(biāo)記，將膠泡在清水中。第三步:加二抗，孵育2h。四、轉(zhuǎn)膜（跑膠時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜用品，最主要趕氣泡）第一步

7、：剪PVDF膜，并提前切角標(biāo)記方向，甲醇中泡1-3min。第二步：將膜、海綿、濾紙一起泡入1X轉(zhuǎn)膜液中,放4C保存。第三步：將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以）在墊子上墊2層濾紙，一手固搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。將膠蓋于濾紙上，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜用鑷子蓋于膠上完全對齊，并除氣泡。在膜上蓋2層濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，合起夾子。整個操作在4C的1 X轉(zhuǎn)膜液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。第四步：將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中，黑對黑，白對紅。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱

8、，過熱有可能造成蛋白質(zhì)的降解，同時大量產(chǎn)熱，會使凝膠膨脹，有可能在膠和膜之間產(chǎn)生空隙，引起轉(zhuǎn)膜不均勻, 所以在轉(zhuǎn)膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。60-70V，調(diào)注：轉(zhuǎn)膜條件是電流 300mA或電壓70V, 2h ;另一個約束條件就是電壓必須控制在節(jié)電流。第五步：轉(zhuǎn)完后將膜放入裝水的小盒中沖洗，倒水后，加5%的封閉液,搖床封閉1h。五.抗體孵育，免疫反應(yīng)第一步：回收封閉液，加入一抗，搖床30min-1h，4 C過夜，再孵育30min-1h。第四步:二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次 5min。第五步:純水沖洗 5-7次，倒掉純水，加化學(xué)發(fā)光，膜在化學(xué)發(fā)光中浸泡2-3min，成像。1.裂

9、解液:實驗藥品試劑母液（動物組織蛋白提取Buffer ）:蛋白酶抑制劑：Pmsf （配）=100:1:1母液常溫放置;蛋白酶抑制劑和 Pmsf需-20 C保存；裂解液需-4 C保存。2.考馬斯亮藍(lán)染液,使用前用無菌水稀釋。3.轉(zhuǎn)膜液的配制（1 X ） 1L試劑劑量Tris3.028gGlali ne （甘氨酸）14.4gSDS1g先定容800ml，調(diào)制PH=8.3，然后+200ml甲醇，混勻。4.蛋白電泳 Buffer （ 5X ） 1L試劑劑量TrisGlali ne （甘氨酸）15g72g5gSDS直接定容至1L,無需滅菌和調(diào) pH;使用前稀釋至1 X。5. 磷酸鹽緩沖液（PBS, 10

10、X ） 500ml試劑劑量NaCI40gKCIigNa HPO 2H O7.2gKH PO1.2g調(diào)制 pH=7.4-7.56. PBST配制1L 的 PBS+5ml 20%Tween207. 封閉液（5% ）脫脂奶粉5g，溶于PBST，定容至1L。8.抗溶于封閉液；二抗溶于PBST。9.按照如下表格配制 SDS-PAGE的濃縮膠（也稱堆積膠、積層膠、上層膠 ）成分10配制不同體積SDS-PAG濃縮膠所需各成分的體積（ml）5%交蒸餾水1.42.12.74.15.530%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31M Tris，pH8.80.250.380.50.751.01

11、0%SDS0.020.030.040.060.0810%±硫酸銨0.020.030.040.060.08TEMED0.0020.0030.0040.0060.00810.根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的分離膠（下層膠）濃度SDS-PAGE分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kD6.80.010.10.11.71.25成分配制不同體積SDS-PAG分離膠所需各成分的體積6%分離膠蒸餾水2.030%Acr-Bis(29:1)1M Tris , pH8.81.01.910%SDS10%±硫

12、酸銨0.050.05TEMED0.00410152030504.06.08.012.020.02.03.04.06.010.03.85.77.611.419.00.10.150.20.30.50.10.150.20.30.50.0080.0120.0160.0240.04（毫升）成分8%分離膠配制不同體積SDS-P AG分離膠所需各成分的體積（毫升）50510152030蒸餾水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris , pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.2

13、0.30.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同體積SDS-P AG分離膠所需各成分的體積（毫升）10%分離膠51015203050蒸餾水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris , pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同體積SDS-P AG分離膠所需各成分的體積（毫升）12%分離膠51015203050蒸餾水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01M Tris , pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%±硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同體積SDS-P A