Western blot實驗操作步驟

1、Western-blot實驗操作步驟制備蛋白樣品（單層貼壁細胞總蛋白提?。?.倒掉細胞培養(yǎng)液，加3ml預(yù)冷的PBS洗滌細胞，重復(fù)兩次，棄掉PBS后將細胞培養(yǎng)瓶置于冰上。2.裂解液RIPA（強）1ml +PMSF10ul（100:1）,兩者混勻后加入培養(yǎng)瓶中裂解細胞，冰上裂解30min,為使細胞充分裂解，培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回搖 動。3.裂解完后，用細胞刮將細胞刮于一側(cè)（動作要快），轉(zhuǎn)移至ep管中.4.4度，12000rpm,離心5min.離心后取上清至新的ep管中，用于后續(xù)實驗（-80保存） 常用蛋白收樣：倒掉細胞培養(yǎng)基后，預(yù)冷PBS洗滌細胞2次，棄去,再加入1ml PBS,用細胞刮輕輕刮取細胞，轉(zhuǎn)

2、移至1.5ml ep管中,12000rpm,離心5min，盡量吸凈上清，沉淀于-80保存，用于后續(xù)實驗。融化蛋白樣品，加入RIPA+PMSF田胞裂解液（200ul/ep管）， 充分混勻，冰上裂解20min,4度離心，5min,12000rpm,小心吸取上清至新的ep管中。二、蛋白濃度測定（BCA法）Western blot實驗步驟BCA（碧云天）蛋白濃度測定試劑盒靈敏度高，檢測濃度下限達到25ug/ml,最小檢測蛋白量達到0.5ug,待測樣品體積為1-20ul。在50-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。標準蛋白BSA濃度：5mg/ml （-20保存），完全溶解蛋白標準品，取10ul

3、稀釋至100ul，使終濃度為0.5mg/ml（ug/ul）。蛋白樣品在什么溶液中,標準品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡便起見，也可以用0.9%NaCI或PBSa釋標準品。1.配置BCA工作液A液：B液二50 : 1，混勻A液+B液=200ul （每個樣本）樣本數(shù)量：7個標準品+ N個待測蛋白樣本2.先將每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白樣本。（96孔板），總體積為10ul.待測蛋白樣本先10倍稀釋。96孔編號#1#2#3#4#5#6#7BSA標準0ul1ul2ul4ul6ul8ul10ul蛋白ddH2010ul9ul8ul6ul4ul2ul0ul96孔待測 蛋白 樣本1待測 蛋白 樣本

4、2待測蛋 白樣本3待測蛋 白樣本N10ul/ well3.37度，溫箱中孵育30min。562nm波長，測0D值。待測蛋白樣品濃度在50-2000ug/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。4.根據(jù)所測樣品的0D直，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線即可計算樣本相應(yīng)的蛋白含量，除以樣本稀釋液總體積（10ul）,再乘以樣本稀 釋倍數(shù)，即為樣本的實際濃度（ug/ul）5.蛋白定量后，以最小蛋白濃度為標準，將各組蛋白樣本調(diào)至相同濃度（ddH2O補齊） 繪制標準曲線：X軸為蛋白質(zhì)量，丫為OD直插入一XY散點圖，選中圖上一點，右鍵，添加趨勢線一選項（顯示公式，顯示R2, R20.99有意義）三、蛋白變性1.室溫融解S

5、DS-PAGE白上樣緩沖液（溴酚藍染料）（2x或5x）2.將適量蛋白樣本與SDS-PAG上樣緩沖液混合，使其終濃度為1x 3.100度或沸水煮3-5min,充分變性蛋白。冷卻至室溫后，直接上樣 到SDS-PAG膠加樣孔內(nèi)即可?；蚶鋮s后-80保存用于后續(xù)實驗。四、蛋白電泳1.配膠：根據(jù)配膠試劑盒操作步驟，按照目的蛋白分子量大小，選擇甘氨酸14.4g蛋白Marker 5ul選擇較好的孔加樣，并記錄加樣位置4.連接電極，跑電泳：電泳條件80V,30min（藍色條帶到達濃縮膠底部）-110V,90min（參考Marker的位置，藍色條帶跑到膠底部即可）相應(yīng)濃度的分離膠。配膠時最后加10%硫酸銨和TEM

6、ED每板分離膠5ml，濃縮膠3ml.短板在內(nèi)側(cè)。配好后如暫時不用,可將膠板取下,電泳液中浸泡，4度保存。2.配電泳液1x甘氨酸-Tris電泳緩沖液1LTris3.03gSDS1g3.蛋白上樣:樣本10-30ul（保證蛋白質(zhì)量最少為30ug) 20-25ul五、轉(zhuǎn)膜甘氨酸14.4g,加水至800ml,最后加甲醇200ml,2.切膠：起膠時將膠留在長玻璃板上，將裁減好的膜做好標記后浸泡在轉(zhuǎn)膜液中。確定目的蛋白的位置（根據(jù)Marker條帶），切膠，保留目的蛋白位置，將膜置于膠上，膜數(shù)字面在上，背面與膠相貼，數(shù) 字標記端貼在Marker上。3.準備轉(zhuǎn)膜：按如下順序-陽極（紅）-濾紙-膜- 膠 紙陰極（黑）4.連接電極，轉(zhuǎn)膜：90V,90min六、圭寸閉1.配封閉液：0.5g脫脂奶粉+ 10ml PBS 2.取下膜，注意蛋白在膜與膠貼合的一面，取下后將膜有蛋白面朝下,封閉1小時 七、 抗體孵育 配抗體稀釋液：0.5g脫脂奶粉，10ul Tween, 10mlPBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度過夜 次日，洗膜液洗4次，每次5min，注意將有蛋白面朝下。孵育二抗, 避光，3