硼替佐米單用或聯(lián)合三尖杉酯堿體外誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究

1、硼替佐米單用或聯(lián)合三尖杉酯堿體外誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究 作者：孫啟鑫，孟凡義，扶云碧，李利【摘要】 本研究探討硼替佐米（bortezomib， Bor）單用或聯(lián)合三尖杉酯堿（harringtonine， HT）對(duì)HL60細(xì)胞凋亡的影響。以不同濃度Bor、HT處理HL60細(xì)胞12-48小時(shí)，采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，以DNA凝膠電泳、熒光顯微鏡檢、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明： 10-50 nmol/L Bor可有效抑制HL60細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡。其中10 nmol/L劑量處理12小時(shí)即有細(xì)胞凋亡發(fā)生，延長(zhǎng)作用時(shí)間或增加藥物劑量可使細(xì)胞凋亡率明顯增加。30 nmol/L H

2、T與10 nmol/L Bor聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可見(jiàn)HL60細(xì)胞凋亡率比兩種藥物單獨(dú)使用時(shí)顯著增加。結(jié)論： Bor對(duì)HL60細(xì)胞具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，與HT聯(lián)合應(yīng)用有明顯的協(xié)同作用。 【關(guān)鍵詞】 硼替佐米； 三尖杉酯堿； 凋亡 Induction of Apoptosis in HL60 Cells by Bortezomib alone or in Combination with Harringtonine In Vitro Abstract The aim of this study was to investigate the effect of bortezomib al

3、one and in combination with harringtonine on apoptosis of HL60 cells. HL60 cells were treated with bortezomib, harringtonine in different concentrations for 12-48 hours. Cell proliferation was analyzed by MTT assay； the apoptosis of HL60 cells was observed by DNA gel electrophoresis， fluorescence mi

4、croscopy and flow cytometry. The results showed that 10-50 nmol/L bortezomib could effectively inhibit HL60 cell proliferation, and induced its apoptosis. After treating for 12 hours, 10 nmol/L bortezomib could trigger cells apoptosis. With time prolongation or dose increase, HL60 cell apoptotic rat

5、e significantly increased. Furthermore, coadministration of bortezomib (10 nmol/L) with harringtonine (30 nmol/L) resulted in a higher cell apoptotic rate when compared with that induced by those agents used alone. It is concluded that the bortezomib can induce HL60 cells apoptosis in a timeanddosed

6、ependent manner and synergistic effectiveness can be found when bortezomib combined with harringtonine. Key words bortezomib; harringtonine; apoptosis J Exp Hematol 2007; 15(2):233-236 急性白血病是一類(lèi)惡性克隆性疾病，雖然其治療水平近年來(lái)已有了明顯提高，但仍有相當(dāng)一部分患者因疾病復(fù)發(fā)或耐藥而轉(zhuǎn)變成難治的白血病，因此積極尋求新的治療方法在當(dāng)前仍然顯得尤為重要。硼替佐米（bortezomib，Bor）是一種新型抗腫瘤

7、靶向治療藥物，目前主要用于復(fù)發(fā)或難治的多發(fā)性骨髓瘤的治療，并已顯示出良好的療效1。研究顯示Bor在體外對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞均具有良好的療效，但在急性白血病方面的研究至今報(bào)道很少，更未見(jiàn)與三尖杉酯堿（harringtonine, HT)聯(lián)合應(yīng)用的研究報(bào)告。本研究首次揭示Bor與HT聯(lián)合作用于HL60細(xì)胞的效果，為臨床用于治療白血病提供理論依據(jù)。 材料和方法 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，MTT、Hoechst33342、碘化丙錠（PI）、RNA酶A、蛋白酶K均為Sigma公司產(chǎn)品。硼替佐米（bortezomib、Velcade、萬(wàn)珂）為美國(guó)Mi

8、llennium公司產(chǎn)品（西安楊森制藥有限公司惠贈(zèng)），用無(wú)菌水配成1 mg/ml濃度備用。三尖杉酯堿注射液為北京協(xié)和制藥廠產(chǎn)品，使用時(shí)稀釋到實(shí)驗(yàn)所需的濃度。 細(xì)胞培養(yǎng) HL60白血病細(xì)胞株購(gòu)自天津血液病研究所，用含10%小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在37、5% CO2條件下培養(yǎng)，1-2天換液1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志 J Exp Hematol 2007; 15(2)硼替佐米或聯(lián)合三尖杉酯堿誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究研究方案 依預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇Bor（10-50 nmol/L）和HT（7.5-75 nmol/L）分別單獨(dú)處理HL60細(xì)胞12-48小時(shí)，觀察藥物

9、劑量反應(yīng)效應(yīng)。根據(jù)藥物反應(yīng)結(jié)果，選擇HT IC50劑量與Bor各濃度聯(lián)合，觀察藥物聯(lián)合后對(duì)HL60細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)。 細(xì)胞增殖活性MTT檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞調(diào)整密度為1105 cells/ml，每孔100 l接種，按要求加入不同濃度處理藥物，終體積200 l/well，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至相應(yīng)的時(shí)間后加入20 l MTT（5 mg/ml），繼續(xù)孵育4小時(shí)。離心并吸棄上清，加DMSO 170 l/well,輕震蕩，酶標(biāo)儀測(cè)570 nm OD值（A）。細(xì)胞活力計(jì)算: 細(xì)胞活力（%）=（A處理組A調(diào)零組/A對(duì)照組A調(diào)零組）100% 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 Hoechst33342以終濃度10 g/ml加入培養(yǎng)板各處理組細(xì)胞中，避光染色15分鐘，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。 DNA提取及電泳 參照文獻(xiàn)2,分別收集各濃度藥物處理的細(xì)胞5105個(gè)，用PBS洗滌1次，加入20 l裂解緩沖液EDTA 20 mmol/L, Tris 100 mmol/L, pH 8.0, 0.8%(w/v) SDS和10 l RNA酶A（10 mg/ml）, 37水浴60分鐘。再加入10 l蛋白酶K（20 mg/ml）,55水浴120分鐘。取20 l樣品加6 l 10DNA上