番茄晚疫病病原菌生物學特性研究[1]

1、番茄晚疫病病原菌生物學特性研究收稿日期:2006-11-20基金項目:國家“863”項目(202AA207013-5作者簡介:康立功(1977-,男,黑龍江人,碩士,研習員,主要從事蔬菜抗病育種工作。*通訊作者E-mail:lijf_2005康立功,許向陽,姜景彬,李景富*(東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院,哈爾濱150030摘要:文章對番茄晚疫病病原菌生長溫度及其污染純化進行了初步研究。結(jié)果表明,番茄晚疫病病原菌可耐最高溫度43,4情況下菌絲仍可以生長,孢子囊在8h 后所有的孢子釋放完畢,同時提出了病原菌污染后純化方法。關(guān)鍵詞:晚疫病;生物特性;純化中圖分類號:S436.412.1+2文獻標識碼:A番茄

2、晚疫病在世界很多國家都有嚴重發(fā)生,如美國、加拿大、墨西哥、法國、瑞士、澳大利亞等國家均有報道。而我國北京、山西、云南、貴州、山東、陜西、河南、河北、四川、湖北等省市也在不同時期報道番茄種植遭受到晚疫病不同程度的危害1。隨著東北地區(qū)番茄栽培面積不斷擴大,同時東北地區(qū)較為冷涼,在番茄青果期雨水較大,故此產(chǎn)生較為適合番茄晚疫病發(fā)生的條件,所以這幾年東北各個地區(qū)也有大面積番茄晚疫病的大發(fā)生,2004年9月哈爾濱市黎明鄉(xiāng)楊家店村12個溫室都遭受到番茄晚疫病的嚴重危害,大部分損失達90%以上,其中個別溫室損失達到了100%。為了更好的防治東北地區(qū)番茄晚疫病,對晚疫病的研究就顯得尤為重要。近幾年我國雖然在晚

3、疫病方面開展一些研究,但仍不深入,筆者針對晚疫病生長溫度及其污染純化方面作了初步的研究,關(guān)于此方面研究國內(nèi)未見報道。1材料與方法1.1病原菌的分離與純化培養(yǎng)病組織分離方法:將番茄組織病葉、莖或果實用0.1%的升汞溶液浸泡35min ,進行表面消毒,在葉片病斑與健康組織交界處用消毒的解剖刀切取12mm 的病組織小塊,投入4%次氯酸鈉溶液中進行再次消毒30s ,然后用無菌水沖洗3次2-3,最后用消毒的鑷子將組織小塊轉(zhuǎn)移到黑麥培養(yǎng)基中,每個培養(yǎng)皿放23塊病樣組織塊,將培養(yǎng)皿放入20的溫箱中培養(yǎng)。當病塊組織生長23d 時,便可以看到白色、稀疏的菌絲環(huán)繞在病樣組織周圍,第4天便可以在無菌操作間內(nèi)、在無菌

4、條件下用消毒的接種鉤挑取菌落邊緣的菌絲體,再次接種到新的黑麥培養(yǎng)基中央,進行多次的分離純化,直至菌落生長整齊一致沒有雜菌出現(xiàn)為止。如果有雜菌出現(xiàn),只能再從病組織上重新分離,所以一旦污染極難純化。單孢分離法:用無菌水將分生孢子從所采集的番茄晚疫病葉片上沖洗下來,稀釋成一定濃度的孢子懸浮液,均勻地涂布于黑麥培養(yǎng)基表面,在顯微鏡下找到平板表面的單個分生孢子,用滅菌的細金屬針將單個孢子轉(zhuǎn)移到新的黑麥培養(yǎng)基表面,在20的生物培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。34d 后在單孢分離的平板培養(yǎng)基上長出白色的小菌落,從這些小菌落的邊緣挑取約12mm 左右的菌絲小塊再次接種到新的黑麥培養(yǎng)基中,在20溫箱內(nèi)培養(yǎng),進行多次純化,直至得到

5、完全純化的培養(yǎng)物。1.2方法1.2.1高溫致死情況將培養(yǎng)10d 左右的番茄晚疫病病菌培養(yǎng)皿直接放入28、30、33、35、37、39、41、43、45、47、49等的恒溫培養(yǎng)箱中,待溫度恒定放入,溫度差在0.2左右,每個處理3次重復,1h 后第39卷第2期東北農(nóng)業(yè)大學學報39(2:1681702008年2月Journal of Northeast Agricultural UniversityFeb.2008文章編號1005-9369(200802-0168-03取出,在無菌操作情況下取菌落邊緣菌絲塊放入新的黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)34d,觀察菌落生長情況。將培養(yǎng)10d左右的番茄晚疫病病菌培養(yǎng)皿放入2

6、8、30恒溫箱中1周,取出在無菌情況下取菌落邊緣菌絲塊放入新的黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)34d,觀察菌落生長情況。將培養(yǎng)10d左右的番茄晚疫病病菌培養(yǎng)皿放入35恒溫箱中1周,在無菌操作情況下取菌落邊緣菌絲塊放入新的黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)34d,觀察菌落生長情況。1.2.2低溫保存情況將培養(yǎng)10d左右的番茄晚疫病病菌培養(yǎng)皿分別放入-20及4冰箱中保存1周、2周、1個月、2個月、6個月后取出,在無菌操作情況下取菌落邊緣菌絲塊放入新的黑麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)34 d,觀察菌落生長情況。1.2.3室溫下孢子囊釋放孢子時間及方式觀察在供試的病菌菌落的邊緣用打孔器打下等菌齡的菌絲小塊,接種到黑麥培養(yǎng)基中央,20恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),

7、培養(yǎng)12d后照取出,將10mL的無菌水注入培養(yǎng)皿內(nèi),沖洗下白色的菌落(分生孢子器,用玻璃棒攪拌,放在室溫下觀察孢子囊釋放孢子情況。1.2.4番茄晚疫病病菌受雜菌污染純化方法番茄晚疫病病菌相對于其他的細菌及真菌生活力更弱,如果污染后很難進一步分離,針對這些做以下試驗:將4葉齡健壯植株在莖部用刀片縱向輕輕割開0.5cm,不要傷及韌皮部,挑出污染的病菌菌絲,盡量將傷口敷滿,然后用濕棉條將傷口裹緊,放入要求24h黑暗、濕度100%、溫度20的恒溫培養(yǎng)箱中,以后要求12h黑暗、12h光照、濕度80%以上、溫度20的生物培養(yǎng)箱中,3d 后觀察發(fā)病情況。2結(jié)果2.1高溫致死情況病菌1h處理結(jié)果表明,當溫度升

8、高到45時,菌絲和孢子失去了活力。溫度保持在43情況下,菌絲和孢子仍然具有活力。病菌在28、30恒溫箱中1周,取出后接到新的黑麥培養(yǎng)基上,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲仍具有生活力。2.2低溫保存情況低溫保存試驗結(jié)果表明,在-20情況下的菌絲1周后死亡,4保存6個月仍然具有活力。2.3室溫下孢子囊釋放孢子時間及方式觀察結(jié)果表明,10min后開始有游動孢子釋放,游動孢子大多聚集在孢子囊附近;3h后游動孢子釋放30%50%(由血球計數(shù)板觀測;8h后觀察基本上所有的孢子釋放完畢(由血球計數(shù)板觀測。2.4番茄晚疫病病菌受雜菌污染純化方法污染的病菌菌絲經(jīng)傷口處理后進行培養(yǎng)的結(jié)果表明,3d后植株開始發(fā)病,將病組織取下,重新

9、進行分離培養(yǎng)及純化,即可得到純的番茄晚疫病菌。3討論番茄晚疫病對溫度相對于敏感,據(jù)國外及臺灣亞洲-世界蔬菜中心等研究人員報道,番茄晚疫病菌耐最高溫度是304。本試驗經(jīng)過反復驗證,番茄晚疫病病菌耐最高溫度可達(43±1(1h,在(45±1(1h情況下才會死亡,并且在28、30兩種條件下保存達1周之久,在此培養(yǎng)仍具有生活力,并且30培養(yǎng)1周仍具有一定的致病性。本試驗為防治番茄種子帶有番茄晚疫病菌提供了良好的理論基礎(chǔ),(43±1沒有做其致病力測定,故此還有待于進一步研究。一直以來人們認為番茄晚疫病菌耐低溫性能極差,所以菌絲的保存用1013生物培養(yǎng)箱4,造成極大的資源浪費

10、,但根據(jù)本試驗得出的結(jié)論番茄晚疫病病原菌可耐到4低溫,但并未作其致病力測定,故此有待于進一步研究。番茄晚疫病病原菌生長勢相對其它菌較弱,所以極易被污染,Wang等認為番茄晚疫病菌一旦被污染將沒有辦法將其純化4,故此番茄晚疫病菌污染后純化一直沒有辦法解決,但我們在試驗中經(jīng)常發(fā)生污染現(xiàn)象,如果錯過了發(fā)病季節(jié),或者外地采集病菌,污染后將給我們造成很大的損失,本純化方法十分實用,同時其他生長較弱的菌污染也可采用此方法進行純化。4結(jié)論番茄晚疫病菌菌絲耐最高溫度可達到43,在4情況下菌絲仍可以生長,經(jīng)8h番茄晚疫病孢子囊可全部將孢子釋放出來,同時本試驗提出了番茄晚疫病病原菌污染純化方法?？盗⒐Φ?番茄晚疫

11、病病原菌生物學特性研究第2期169參考文獻1馮蘭香,楊宇紅,謝丙炎,等.中國18省市番茄晚疫病菌生理小種的鑒定J.園藝學報,2004,(306:50-53.2王秋霜.番茄斑枯病病源菌的鑒定及抗病種質(zhì)資源篩選J.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2005.3王彥杰.番茄早疫病病源菌的鑒定及抗病種質(zhì)資源篩選D.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2004.4Wang T C.Determination of physiologica racesC/Training workshopon tomatolate blight research in China.Beijing:Institute ofVegetables an

12、d Flowers,Chinese AcademyofAgricultural Scien-ces,2003.Biological characteristics of late blight in tomatoKANG Ligong,XU Xiangyang,JIANG Jingbin,LI Jingfu(College of Horticulture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,ChinaAbstract:The paper researched the growth temperature and contamination purification method of late blight pathogen in tomato.The results showed that late blight in tomato could be tolerant to43,meanwhile the mycelium of late blight in tomato could grow u