酪氨酸激酶抑制劑逆轉(zhuǎn)黏附誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性(1)

1、    酪氨酸激酶抑制劑逆轉(zhuǎn)黏附誘導(dǎo)的骨髓瘤細(xì)胞的耐藥性(1)    】 為了探討酪氨酸激酶抑制劑STI571對RPMI8226細(xì)胞黏附、黏附誘導(dǎo)耐藥以及靶細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)的影響，本研究采用結(jié)晶紫染色法分析了RPMI8226細(xì)胞與纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的黏附率，用MTT法檢測瘤細(xì)胞的增殖性，并用半定量RT-PCR研究Rac1 mRNA水平的變化。結(jié)果顯示：RPMI8226細(xì)胞與FN黏附1、6、12小時(shí)，其黏附率分別為(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)

2、%、(63.42±2.46)%；用20 mol/L STI571處理1、6、12小時(shí)后黏附率分別降為(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；組間差異顯著（P0.05）；阿霉素作用后，F(xiàn)N黏附組細(xì)胞IC50值（1.46±0.04）mol/L顯著高于BSA組（0.78±0.03）mol/L(P0.05)；FN聯(lián)合STI571組IC50值(0.81±0.05)mol/L與BSA聯(lián)合STI571組（0.74±0.02）mol/L相比無顯著性差異（P0.05），但卻低于FN組(P0

3、.05)；半定量RT-PCR顯示，Rac1 mRNA水平在20 mol/L STI571處理14小時(shí)后明顯下降。結(jié)論：STI571能降低RPMI8226細(xì)胞與FN的黏附率、逆轉(zhuǎn)黏附介導(dǎo)的阿霉素耐藥，并且可以下調(diào)其Rac1 mRNA水平。 【關(guān)鍵詞】 骨髓瘤細(xì)胞Tyrosine Kinase Inhibitor Reverses Adriamycin Resistance Mediated by Cell Adhesion in RPMI8226 CellsAbstract    To study the effects of tyrosine-kinas

4、e inhibitor STI571 on the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin(FN)，cell adhesion mediated adriamycin-resistance and the Rac1 mRNA expression，the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin and drug resistance mediated by cell adhesion were determined by means of crystal violet staining and MTT as

5、says respectively，Rac1 mRNA levels in RPMI8226 cells were examined by semi-quantitative RT-PCR.The results showed that STI571 could inhibit the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin.When RPMI8226 cells had been adhe-red to FN or BSA-coated wells for 1，6 and 12 hours，the adhesion rates

6、were (43.71±2.18)%，(55.63±1.56)%，and (63.42±2.46)% respectively.After treatment with STI571 20 mol/L，the adhesion rates decreased to (15.12±1.04)%，(17.58±1.32)% and (17.24±1.59)% respectively (P0.05).The experiment revealed that growth of RPMI8226 cells adhered to FN-co

7、ated plates had a significant advantage over growth on BSA-coated plates when exposed to adriamycin (Adr) for 1 hour followed by a 24-hour culture period，and the mean IC50 value for FN-adhered cells was (1.46±0.04) mol/L while mean IC50 value for BSA control was (0.78±0.03)mol/L (P0.05).Fo

8、llowing treatment with 20 mol/L STI571，the mean IC50 values for FN and BSA adhered cells were (0.81±0.05)mol/L，(0.74±0.02)mol/L respectively，there was no significant difference between them（P0.05）.RT-PCR demonstrated that the relative Rac1 mRNA level (Rac1/GAPDH) in RPMI8226 cells was down

9、regulated following being treated with 20mol/L STI571.It is concluded that STI571 can inhibit the adhesion of RPMI8226 cells to fibronectin，reverse cell adhesion mediated adriamycin-resistance，and downregulate Rac1 mRNA level.Key words tyrosine-kinase inhibitor; STI571; myeloma cell; RPMI8226 cell;

10、adhesion; drug resistance多發(fā)性骨髓瘤（MM）至今之所以被認(rèn)為是一種難以治愈的漿細(xì)胞惡性腫瘤，是因?yàn)榱黾?xì)胞最終會(huì)產(chǎn)生多藥耐藥，其中MM細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）間黏附在耐藥中占有重的地位，作為細(xì)胞與ECM之間作用的主介導(dǎo)分子整合蛋白（integrin）與纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N)結(jié)合對凋亡抑制、 細(xì)胞存活具有重作用。 Damiano等1發(fā)現(xiàn)，經(jīng)阿霉素（adriamycin，Adr）處理后，與FN黏附的骨髓瘤細(xì)胞比不黏附者具有明顯的生長優(yōu)勢和較低的凋亡率，他們稱這一現(xiàn)象為細(xì)胞黏附介導(dǎo)的耐藥（cell adhesion

11、 mediated drug resistance，CAM-DR），采用封閉性抗體阻斷整合蛋白與FN間的相互作用后，瘤細(xì)胞與FN間的黏附率明顯下降，CAM-DR得以完全逆轉(zhuǎn)。    肌動(dòng)蛋白（actin）細(xì)胞骨架重構(gòu)與細(xì)胞黏附密切相關(guān)，Abl酪氨酸激酶與RhoGTP酶Rac1是actin細(xì)胞骨架的重調(diào)控分子。因此，Abl與Rac1極可能涉及MM細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(entracellular matrix，ECM)間的黏附過程以及靶細(xì)胞的CAM-DR形成。那么抑制Abl激酶活性能否逆轉(zhuǎn)黏附誘導(dǎo)的MM細(xì)胞耐藥呢？針對這一問題，我們以人骨髓瘤細(xì)胞株RPMI822

12、6為研究對象，進(jìn)一步探討Abl激酶抑制劑STI571對MM細(xì)胞CAM-DR的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)介導(dǎo)機(jī)理。材料和方法試劑STI571由諾華制藥公司惠贈(zèng)，分子式為C29H31N7O·CH4SO3，分子量589.7。1粒膠囊含STI571 100 mg，用二甲亞砜（DMSO，Amrosco產(chǎn)品）充分溶解，離心去沉渣，以無菌注射用水稀釋至1 mmol/L，分裝，-20貯存。小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。四氮唑藍(lán)（MTT）、結(jié)晶紫（crystal violet）、阿霉素均為Sigma產(chǎn)品。纖連蛋白為Becton Dickinson公司產(chǎn)品，注射用水溶解，分裝，-20凍存。Taq酶購

13、自大連TaKaRa公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購Promega公司；RNA提取試劑TRIzoL購自Invitrogen公司；Rac1及內(nèi)參照3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）引物均由上海Sangon公司合成。細(xì)胞培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI8226細(xì)胞來源于ATCC，由第四軍醫(yī)大學(xué)病理學(xué)教研室惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)于含100 ml/L滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置5% CO2、飽和濕度、37培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，2-3天傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞處于指數(shù)生長期。黏附實(shí)驗(yàn)用無菌過濾的TSM buffer(20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，2

14、mmol/L MgCl2，pH 8.0 )2分別配制50 g/ml的FN及1% BSA，每孔50 l包被96 孔板，4過夜，用 1% BSA封閉2小時(shí)。實(shí)驗(yàn)分為4組：FN組：單純用FN (50 g/ml)包被；對照組（BSA組）：單純用1% BSA包被；STI571 FN組；STI571 BSA組。RPMI8226細(xì)胞經(jīng)無血清RPMI 1640培養(yǎng)12小時(shí)，并以20 mol/L 濃度的STI571(行細(xì)胞毒預(yù)實(shí)驗(yàn)測得)預(yù)孵育2小時(shí)后，按2.0×104細(xì)胞/孔，種入96孔板，每組平行3孔。37、5% CO2分別培養(yǎng)1、6、12小時(shí)（期間不去除STI571）。用RPMI 1640 培養(yǎng)液

15、洗板3次，70%甲醇固定10分鐘，洗板晾干。0.02%結(jié)晶紫染色10分鐘1，PBS 洗去多余染料，再以0.2% Triton X-100溶解細(xì)胞，酶聯(lián)免疫儀上測定各孔570 nm OD值，以含2.0×104細(xì)胞/孔為總OD值（100%）。細(xì)胞黏附率(%) =實(shí)驗(yàn)組OD值/總OD值×100%。            作者：潘耀柱，陳協(xié)群，高廣勛，顧宏濤，張永清，董寶俠，白慶咸，朱華峰【摘】為了探討酪氨酸激酶抑制劑STI571對RP  &#

16、160;      本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。MTT檢測實(shí)驗(yàn)分4組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔：FN Adr組；BSA Adr組；STI571 Adr FN組；STI571 Adr BSA組。FN包被及STI571處理同前。取指數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞按1.0×104細(xì)胞/孔種入96孔板，黏附12小時(shí)，每組分別加入以下濃度Adr：0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mol

17、/L，作用1小時(shí)，離心棄上清，加完全RPMI 1640液培養(yǎng)24小時(shí)后，加入MTT溶液（5 mg/ml）10 l，37孵育4小時(shí)，每孔加入100 l 10% SDS（含0.01 N HCl），充分溶解結(jié)晶物3，570 nm波長測定各孔OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。生長抑制率()=(1-試驗(yàn)組A值/對照組A值)×100。RT-PCR檢測取指數(shù)生長期細(xì)胞分為20 mol/L STI571處理組與空白對照組，1×106個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)14小時(shí)后，采用TRIzoL試劑提取總RNA。RNA反轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于95變性5分鐘，開始PCR的熱循環(huán)：94變性40秒，

18、51退火40秒，72延伸40秒，共28個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72延伸10分鐘，4保存。Rac1及GAPDH引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)4。Rac1上游引物為5-AGG AAG AGA AAA TGC CTG-3，下游引物為5-AGC AAA GCG TAC AAA GGT-3，產(chǎn)物長度為80 bp；GAPDH上游引物為5-TCG GAG TCA ACG GAT TTG GTC GTA-3，下游引物為5-TGG CAT GGA CTG TGG TCA TGA GTC-3，產(chǎn)物長度為525 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行灰度值掃描，并以軟件Genetools分析，以目的條帶與內(nèi)參照條

19、帶的比值（Rac1/GAPDH）代表目的基因mRNA相對水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)，行T-test分析。    結(jié)果STI571對RPMI8226細(xì)胞黏附的抑制作用隨著時(shí)間延長，RPMI8226細(xì)胞與FN的黏附率逐漸上升，1、6、12小時(shí)黏附率分別為(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；20 mol/L STI571處理組1、6、12小時(shí)后黏附率分別降為(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59

20、)%；與對照組相比相差顯著(P0.05)，表明STI571能顯著降低RPMI8226細(xì)胞與FN的黏附（圖1）。STI571逆轉(zhuǎn)RPMI8226細(xì)胞CAM-DR經(jīng)Adr作用后，BSA對照組RPMI8226細(xì)胞凋亡，并有良好的濃度依賴關(guān)系，其IC50為（0.78±0.03）mol/L；靶細(xì)胞與FN黏附后Adr誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯減弱，其IC50（1.46±0.04）mol/L顯著高于BSA組(P0.05)，表明靶細(xì)胞黏附能提高其耐受Adr細(xì)胞毒作用，即產(chǎn)生了細(xì)胞耐藥；而FN聯(lián)合STI571處理組IC50(0.81±0.05)mol/L，明顯低于FN組(P0.05)，說明

21、STI571能逆轉(zhuǎn)骨髓瘤細(xì)胞因黏附介導(dǎo)的耐藥；BSA聯(lián)合STI571組IC50 （0.74±0.02）mol/L與BSA組（0.78±0.03) mol/L相比無顯著性差異（P0.05），說明STI571下調(diào)靶細(xì)胞IC50作用并非是由于STI571與Adr的協(xié)同作用所引起的（圖2）。STI571下調(diào)RPMI8226細(xì)胞Rac1 mRNA表達(dá)Rac1 mRNA在RPMI8226細(xì)胞中高表達(dá)，其RP-PCR產(chǎn)物相對灰度值為1.65±0.15 (lane 1)，20 mol/L STI571處理瘤細(xì)胞14小時(shí)后灰度值降為0.81±0.18(lane 2)，表明

22、STI571能夠下調(diào)靶細(xì)胞Rac1 mRNA 表達(dá)（圖3）。討論Abl屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶家族成員，大部分定位于核內(nèi)，少部分在胞漿。其功能因Abl在細(xì)胞內(nèi)定位不同而不同，核內(nèi)Abl主涉及細(xì)胞周期、凋亡等過程，而胞漿Abl則參與細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重構(gòu)調(diào)控。細(xì)胞功能狀態(tài)影響Abl定位及生物學(xué)活性。例如，成纖維細(xì)胞和FN黏附結(jié)合后，Abl激酶活性可上升1.9-6.8倍5，6，并能快速從核內(nèi)到胞漿，結(jié)合到纖維狀肌動(dòng)蛋白（filament actin，F(xiàn)-actin），促使F-actin聚合及粘著斑(focal adhesion)形成7，8。這表明Abl激酶在細(xì)胞黏附過程中發(fā)揮著重作用。 

23、;   鑒于不同類型細(xì)胞的黏附過程可能具有某些共同的生物學(xué)特征，我們推測Abl激酶也可能參與MM細(xì)胞的黏附調(diào)控過程。2002年De-Vos等9采用寡核苷酸陣列分析技術(shù)證實(shí)，Abl基因在惡性漿細(xì)胞中的表達(dá)高于正常漿細(xì)胞2.9倍。這一事實(shí)為研究Abl與MM細(xì)胞黏附間的關(guān)系提供了生化基礎(chǔ)。那么能否用Abl酪氨酸激酶抑制劑STI571來抑制骨髓瘤細(xì)胞的黏附，從而逆轉(zhuǎn)其CAM-DR？我們用FN黏附RPMI8226細(xì)胞1、6、12小時(shí)，黏附率依次遞增，分別為(43.71±2.18)%、(55.63±1.56)%、(63.42±2.46)%；而對應(yīng)

24、的STI571處理組黏附率分別為(15.12±1.04)%、(17.58±1.32)%、(17.24±1.59)%；組間差異顯著，說明STI571能明顯抑制MM細(xì)胞的黏附，與此同時(shí)，靶細(xì)胞對阿霉素的IC50下降。這一結(jié)果表明，STI571能夠部分逆轉(zhuǎn)MM細(xì)胞的耐藥性，也為進(jìn)一步研究Abl調(diào)控F-actin聚合以及CAM-DR形成提供了初步依據(jù)。    本研究還發(fā)現(xiàn)，20 mol/L STI571可顯著下調(diào)骨髓瘤細(xì)胞Rac1 mRNA水平。Rac1屬于小G 蛋白R(shí)ho家族成員，參與actin細(xì)胞骨架調(diào)控，對細(xì)胞黏附過程有重影響

25、10，11，活化的Rac1可促進(jìn)細(xì)胞粘著斑形成，這種作用可以被Rac的負(fù)顯性突變體阻斷。那么在細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)中Abl與Rac1關(guān)系如何呢？研究表明：Abl激酶可通過某些中間環(huán)節(jié)活化Rac1進(jìn)而促使actin聚合，參與細(xì)胞黏附12，13。這一結(jié)果提示Rac1可能作為Abl下游分子參與細(xì)胞黏附的調(diào)控。本研究證實(shí)，STI571可下調(diào)Rac1表達(dá)，抑制骨髓瘤細(xì)胞黏附。這一結(jié)果既提示Abl激酶抑制劑 STI571對骨髓瘤細(xì)胞黏附功能的干擾可能與Rac1表達(dá)受抑密切相關(guān)，同時(shí)也為Abl激酶通過Rac1間接調(diào)控MM細(xì)胞黏附這一新觀點(diǎn)提供了又一實(shí)驗(yàn)佐證?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Damiano JS，Cress AE，H

26、azlehurst LA，et al. Cell adhesion mediated drug resistance (CAM-DR): role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell lines.Blood，1999; 93:1658-16672 Zhang Z，Rehmann H，Price LS，et al. AF6 negatively regulates Rap1-induced cell adhesion.J Biol Chem，2005; 280: 33200-332053 Qiang YW，

27、Kitagawa M，Higashi M，et al. Activation of mitogen-activated protein kinase through alpha5/beta1 integrin is required for cell cycle progression of B progenitor cell line，Reh，on human marrow stromal cells. Exp Hematol，2000; 28: 1147-11574 Zhao X，Carnevale KA，Cathcart.Human Monocytes Use Rac1，not Rac2

28、，in the NADPH Oxidase Complex.J Biol Chem，2003; 278: 40788-40792            作者：潘耀柱，陳協(xié)群，高廣勛，顧宏濤，張永清，董寶俠，白慶咸，朱華峰【摘】為了探討酪氨酸激酶抑制劑STI571對RP         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲

29、，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。5 Lewis JM，Baskaran R，Taagepera S，et al. Integrin regulation of c-Abl tyrosine kinase activity and cytoplasmic-nuclear transport.Proc Natl Acad Sci USA.1996; 93: 15174-151796 Woodring PJ，Litwack ED，OLeary DD，et al. Modulation of the F-actin cytoskeleton by c-Abl tyrosine kinase in cell spreading and neurite extension.J Cell Biol，2002;156: 879-8927 Woodring PJ，Hunter T，Wang JY，et al. Regulation o