鈉氫交換蛋白-1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪對HL-60ADM細胞pHi變化及細胞增殖、凋亡的

1、鈉氫交換蛋白-1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪對HL-60/ADM細胞pHi變化及細胞增殖、凋亡的    作者：常城，孔佩艷，陳幸華，彭賢貴，劉林，劉紅，曾東風，梁雪，王慶余    【摘要】 為了探討鈉氫交換蛋白-1（NHE-1）抑制劑二甲基氨氯吡咪（DMA）對HL-60/ADM細胞pHi變化及細胞增殖、凋亡的影響，以敏感HL-60細胞為對照，用不同濃度的DMA干預(yù)后，熒光指示劑（BCECF/AM）檢測法檢測細胞內(nèi)pHi，微量噻唑藍法（MTT）檢測細胞生長的抑制率，流式細胞術(shù)檢測細胞周期變化，TUNEL法檢測原位細胞凋

2、亡，對比HL-60/ADM細胞與HL-60細胞之間的差異。結(jié)果顯示： HL-60/ADM細胞內(nèi)pHi較HL-60細胞顯著升高；DMA作用下，HL-60/ADM細胞的pHi降低幅度、生長抑制率、細胞凋亡率均顯著高于HL-60細胞；當DMA濃度100-150 mol/L時，HL-60/ADM細胞的G0/G1期細胞比率增加幅度、S期及G2/M期細胞比率降低幅度均高于HL-60細胞。 結(jié)論： NHE-1特異性抑制劑DMA引起HL-60/ADM的pHi降低，可抑制細胞生長并誘導(dǎo)細胞凋亡；且DMA對HL-60/ADM細胞的生長抑制作用顯著高于HL-60細胞。    

3、【關(guān)鍵詞】 鈉/氫交換蛋白-1 Effect of the NHE-1-Specific Inhibitor DMA on pHi，Proliferation and Apoptosis of HL-60/ADM Cells In Vitro Abstract    The aim of this study was to evaluate the effect of dimethyl amiloride (DMA)，a specific inhibitor of Na /H exchanger-1 (NHE-1)，on intracellular pH

4、 value(pHi)，proliferation and apoptosis of HL-60/ADM cells in vitro. After treatment with DMA at different doses，pHi of HL-60 and HL-60/ADM cell lines were determined by using pH-sensitive fluorescence dye BECEF-AM; the rate of growth inhibition of cells was detected with MTT assay; cell cycle was d

5、etected by flow cytometric DNA analysis; cell apoptosis was observed with terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The results showed that pHi in HL-60/ADM cells was higher than that in HL-60 cells. After treatment with DMA at different doses，pHi decreased，the r

6、ate of growth inhibition and the rate of apoptotic cells in HL-60/ADM cells were all higher than those in HL-60 cells. Meanwhile，after treatment with DMA during 100 mol/L to 150 mol/L，the increase amplitude of G0/G1 phase cells and the decrease amplitude of SG2/M cells in HL-60/ADM cells were higher

7、 than those in HL-60 cells. It is concluded that by causing intracellular acidification，the NHE-1-specific inhibitor DMA inhibits proliferation of HL-60/ADM cells and induces apoptosis of HL-60/ADM cells，and the degree of this growth inhibition of HL-60/ADM cells is higher than that of HL-60 cells.

8、Key words NHE-1; dimethyl amiloride; HL-60/ADM cell; pHi; cell proliferation; apoptosis 鈉/氫交換蛋白-1（Na /H exchanger-1，NHE-1）廣泛存在于真核細胞膜上，介導(dǎo)細胞內(nèi)外11鈉/氫交換以維持細胞內(nèi)的pH值（intracellular pH value，pHi）。NHE-1表達增高和（或）活化可引起細胞內(nèi)堿化，促進細胞增殖，相反則可導(dǎo)致細胞內(nèi)酸化，促進細胞凋亡1，2。凋亡抑制是白血病多藥耐藥（MDR）產(chǎn)生的重要機制之一3，本研究以HL-60細胞株為對照，檢測NHE-1特異性抑制劑二甲基氨

9、氯吡咪（dimethyl amiloride，DMA）作用下，阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生多藥耐藥的HL-60細胞株（HL-60/ADM）pHi改變及其細胞增殖、凋亡變化，探討DMA對HL-60/ADM細胞生長的影響。 材料和方法 材料 細胞株 HL-60細胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)復(fù)合傷研究所提供。阿霉素誘導(dǎo)的耐藥HL-60細胞株(HL-60/ADM)購自天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實驗前經(jīng)檢測證實，該細胞株對臨床常用多種化療藥物耐藥，細胞表面表達多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP），細胞內(nèi)拓撲異構(gòu)酶（Topo）增高。 試劑及儀器    BCECF-AM購自美國Eugene公司，

10、RPMI 1640培養(yǎng)液、標準胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品，尼日利亞菌素（nigericin）、DMA、噻唑藍（MTT）、二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。其他常規(guī)試劑為國內(nèi)試劑公司產(chǎn)品，分析純。美國PE公司LS-50B熒光分光光度計，國產(chǎn)酶聯(lián)免疫分析儀。氯化鈉緩沖液（PSS，pH 7.4，37）、氯化鉀緩沖液（37下用1N鹽酸和1N氫氧化鉀分別調(diào)定pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6）參照文獻4自行配制。MTT溶于PBS液，工作液濃度為5 mg/ml。 細胞培養(yǎng) 用含10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（用1N鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.2），于飽和濕度，5 CO2、37

11、培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HL-60/ADM細胞株常規(guī)培養(yǎng)加入阿霉素0.5 g/ml，實驗前無藥培養(yǎng)1周。 pHi檢測 熒光強度比值（FIR）測定 按BCECF-AM法4進行。取對數(shù)生長期的細胞，以1×106細胞重懸于1 ml PBS液中；加入不同濃度DMA，37孵育30分鐘；加入BCECF-AM（終濃度1 g/ml），37孵育30分鐘；PSS漂洗后置于LS-50B分光光度計上用雙波長比例測量法檢測，激發(fā)波長為495 nm和440 nm，發(fā)射波長為530 nm。FIR495 nm/440 nm。 pHi標準曲線制作 參照文獻4進行。細胞分別重懸于上述不同pH值氯化鉀緩沖液中，加入BCECF-AM

12、、Nigericin（終濃度5 mol/L）孵育30分鐘，以pH值和對應(yīng)FIR求出回歸方程，作出pHi標準曲線。根據(jù)此曲線將檢測FIR轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的pHi值。 細胞生長抑制率的MTT法檢測 取對數(shù)生長期細胞，用含10胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為1×105/ml，接種于96孔板，0.2 ml/well。同時分別加入不同濃度DMA，每種濃度設(shè)4個復(fù)孔，設(shè)置不加DMA的陰性對照孔和不加細胞的空白對照孔。常規(guī)培養(yǎng)48小時后加入MTT工作液20 l/well，孵育5小時，離心后棄上清，加入DMSO 0.15 ml/well，震蕩10分鐘使結(jié)晶充分溶解，酶標儀570 nm波長檢

13、測OD值，根據(jù)OD值計算相應(yīng)抑制率。 抑制率1（OD檢測OD空白）/（OD陰性O(shè)D空白） 細胞周期檢測 對數(shù)生長期細胞加入不同濃度DMA共同培養(yǎng)24小時，細胞懸液用70%的冷乙醇固定后，調(diào)整細胞濃度為106/ml；PI染色(50 g/ml)，4避光孵育30分鐘，在流式細胞儀(美國FACS)上進行檢測。    原位細胞凋亡率檢測 對數(shù)生長期細胞分別與不同濃度DMA共同培養(yǎng)12、24、48小時，離心涂片機涂片；采用TUNEL法，封片后光鏡高倍鏡（×400）下觀察，至少觀察5個視野，計數(shù)200個細胞以上，計算陽性細胞百分率。 統(tǒng)計分析 細胞周期檢測數(shù)

14、據(jù)采用總體率假設(shè)檢驗。其余數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±SD）表示，用Microsoft Excel 2000軟件進行t檢驗。 結(jié) 果 pHi變化 HL-60/ADM細胞pHi值較HL-60細胞顯著增高（P0.01）。用不同濃度的DMA干預(yù)后，HL-60/ADM細胞內(nèi)pHi降低幅度高于HL-60細胞（表1）。Table 1. pHi value of HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentration of DMA（略）    DMA對細胞生長的抑制率

15、 在不同濃度DMA作用下，HL-60/ADM細胞生長的抑制率均高于HL-60細胞，且DMA對細胞生長抑制率隨劑量增加而增高，HL-60/ADM對劑量增加更為敏感（表2）。Table 2. Growth inhibition rates of HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentration of DMA （略） 不同細胞周期的細胞比率變化 當DMA濃度為100-150 mol/L時，HL-60細胞及HL-60/ADM細胞的G0/G1期細胞比率均顯著高于未加藥時，S期及G2/M期細胞比率均顯著低于未加藥時

16、，且HL-60/ADM細胞的G0/G1期細胞比率 增加幅度、S期及G2/M期細胞比率降低幅度高于HL-60細胞（表3）。Table 3. Cell ratio changes of HL-60 and HL-60/ADM cells in various phases of cell cycle after treatment with different concentrations of DMA （略） 細胞凋亡檢測 在DMA作用下各組凋亡率均較對照組顯著增高（P<0.01），凋亡率隨藥物濃度和作用時間的增加而增高（表4）。Table 4. Cell apoptosis rate o

17、f HL-60 and HL-60/ADM cells after treatment with different concentrations of DMA （略） 討 論 MDR是導(dǎo)致白血病及其他各種惡性腫瘤化療失敗的最主要原因。目前已知存在多種MDR機制，且在同一種耐藥細胞內(nèi)可能存在多種耐藥機制，這使得逆轉(zhuǎn)MDR更加困難。Larsen等5發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)堿化是腫瘤細胞MDR產(chǎn)生后的共同變化，且與何種耐藥機制無關(guān)。我們測得HL-60細胞株的pHi為7.387±0.054，與文獻報道一致6，耐藥的HL-60/ADM細胞株pHi為7.478±0.044，較HL-60細胞株顯著

18、增高，證實MDR細胞有比敏感細胞更高的pHi。目前已知，腫瘤細胞pHi的升高可改變化療藥物的分布，減少堿性化療藥物與靶位的結(jié)合。許多化療藥物結(jié)合到細胞內(nèi)靶點是pH依賴性的，輕微的細胞內(nèi)pH梯度的改變即可對藥物蓄積、胞噬和分泌產(chǎn)生影響。在化療藥物負荷下，腫瘤細胞內(nèi)可以出現(xiàn)包含藥物的酸性囊泡，通過胞吐作用將化療藥物排出胞體外。敏感細胞內(nèi)酸性囊泡數(shù)量比耐藥細胞少，提示敏感細胞活性分泌通道移除藥物分子的能力較低6，7。這提示pHi的增高可影響細胞對化療藥物的敏感性，可能是白血病細胞產(chǎn)生MDR的必要條件之一。    本研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度DMA作用下，HL-60/

19、ADM細胞的生長抑制率、細胞凋亡率均顯著高于HL-60細胞，G0/G1期細胞比率顯著高于HL-60細胞，S期及G2/M期細胞比率顯著低于HL-60細胞，這些結(jié)果說明在一定范圍內(nèi)HL-60/ADM細胞對DMA更為敏感。有研究表明，拓撲異構(gòu)酶抑制劑（如喜樹堿）是通過改變pHi來誘導(dǎo)和/或促進細胞凋亡的，耐藥HL-60細胞能夠抵抗這種細胞內(nèi)酸化現(xiàn)象的產(chǎn)生，因而獲得耐藥性；多藥耐藥HL-60細胞內(nèi)，Bcl-2的表達和磷酸化明顯多于敏感細胞，并且不受凋亡誘導(dǎo)劑調(diào)控，這與耐藥細胞pHi相對較高的現(xiàn)象一致8，9。    NHE-1是細胞內(nèi)pH值最主要的調(diào)節(jié)者，其表達及

20、活性直接影響細胞內(nèi)pH值的水平。有報道顯示，NHE-1表達及活性增強導(dǎo)致細胞凋亡抑制10。陳杰11等運用抑制消減雜交技術(shù)篩選耐藥及敏感肺癌細胞差異表達基因，發(fā)現(xiàn)耐藥細胞表達增強的片段之一與NHE-1有高度的同源性，提示NHE-1在多藥耐藥中可能存在重要作用。NHE-1如何導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生MDR尚需要進一步研究，NHE-1介導(dǎo)的pHi升高很可能是MDR產(chǎn)生的重要機制之一，抓住這個共同途徑“研究MDR產(chǎn)生機制，可能為尋找逆轉(zhuǎn)MDR的方法提供新的思路。既然DMA作為NHE-1特異性抑制劑，可通過改變NHE-1活性來降低細胞內(nèi)pH值，那么運用DMA作用于耐藥白血病細胞能否增加細胞內(nèi)化療藥物的有效分布、

21、降低耐藥細胞凋亡閾值，以達到逆轉(zhuǎn)MDR的作用，這是值得進一步探討的。 【參考文獻】 1Quinn DA，Du HK，Thompson BT，et al. Amiloride analogs inhibit chronic hypoxic pulmonary hypertension . Am J Respir Crit Care Med，1998; 157（4 Pt 1）:1263-12682吳國明，錢桂生，黃桂君等. 鈉-氫交換蛋白1反義表達載體對人肺腺癌細胞鈉-氫交換蛋白1基因表達的影響及其意義. 中華結(jié)核和呼吸雜志，2004; 27: 191-1943Malinowska I，Stelm

22、aszczyk-Emmel A，Wasik M，et al. Apoptosis and pH of blasts in acute childhood leukemia. Med Sci Monit，2002; 8: CR441-4474Zhu WH，Loh TT. Effects of Na /H antiport and intracellular pH in the regulation of HL-60 cell apoptosis. Biochim Biophys Acta，1995; 1269: 122-1285Larsen AK，Escargueil AE，Skladanows

23、ki A. Resistance mechanisms associated with altered intracellular distribution of anticancer agents. Pharmacol Ther，2000; 85: 217-2296Wang E，Lee MD，Dunn KW. Lysosomal accumulation of drugs in drug-sensitive MES-SA but not multidrug-resistant MES-SA/Dx5 uterine sarcoma cells. J Cell Physiol，2000; 184: 263-2747Weisburg JH，Curcio M，Caron PC，et al. The