非綜合征性唇腭裂與TGF2多態(tài)性的相關研究

1、非綜合征性唇腭裂與TGF2多態(tài)性的相關研究            【關鍵詞】  唇腭裂    摘要  目的：探討轉(zhuǎn)移生長因子2(transforming growth factor-2,TGF2)多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL±P）的相關性。方法：應用聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)（PCR-SSCP）方

2、法，以103名健康體檢者為對照，配對研究了124名非綜合征性唇腭裂患者TGF2基因的多態(tài)性。結(jié)果：對照組與患者組TGF2兩者相比較，在統(tǒng)計學上有顯著性差異（X2=16.235，df=1,P<0.005）；單獨發(fā)生唇裂或腭裂者與唇腭裂同時并發(fā)者比較，在統(tǒng)計學上有顯著性差異（X2=15.885，df=1,P<0.005）；其他配對比較均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：非綜合征性唇腭裂的發(fā)生與TGF2基因多態(tài)性有相關性。關鍵詞  唇腭裂  遺傳學  轉(zhuǎn)移生長因子2  多態(tài)性Evidence for Association between Nonsyndromi

3、c Cleft Lip with or without Cleft Palate and Transforming growth factor-2 Polymorphisms. JIAO  Xiao-hui, WANG  Li. The dental hospital Affiliated Hospital of Harbin medical university, Harbin 150001AbstractObjective: To study the relationship between transforming growth factor-2（TGF2） poly

4、morphisms and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL±P) . Methods: TGF2 was examined by polymerase chain reaction-single strand conformation polymprphism (PCR-SSCP) technique  in the 124 patients with NSCL±P and 103 healthy persons. Results: In the comparisons betwe

5、en the controls and the patients, the patients with cleft lip or cleft palate and the patients with cleft lip and palate,  the results were respectively（X216.235,df=1,P<0.005；X215.885,df=1,P<0.005）. So there was statistical significance. In other comparisons, there was no statistical sign

6、ificance. Conclusion: The above results give strong evidence for the association of TGF2 with development of NSCL±P.Key words  Cleft lip and palate  Genetics  Transforming growth factor-2  Polymorphism    非綜合征性唇裂伴或不伴腭裂（nonsyndromic cleft with or without cleft

7、palate, NSCL±P）是胚胎發(fā)育過程中腭突融合不全所致，這是新生兒畸形中最常見的一種，發(fā)生率為0.801.00。在所有唇腭裂患者中，大部分以非綜合征形式表現(xiàn)出來，約占50%70%,而且由于不同人種5個病人中就有1名有唇腭裂（CLP）家族史，遺傳性因素被認為起重要作用。目前，已證實6p24、2p13、19q13、1q41 、17q21、14q24均與CL±P的發(fā)生有關聯(lián)。TGF2與人類1q41匹配，Nishimura1 ，Ausuko等2的研究表示TGF2與NSCL±P的發(fā)生有明確相關性。大量的研究是以西方人種作為研究對象，對亞洲人種相類似的研究甚少，因此，

8、我們觀察了中國北方地區(qū)唇腭裂發(fā)生情況，分析了TGF2基因多態(tài)性與NSCL±P的相關關系。1  材料與方法1.1  對象  自2000年9月至2001年3月，在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院口腔頜面外科就診的唇腭裂患者，排除為我們所了解的例如范伍德綜合征、歌舞伎面譜綜合征、MECKEL綜合征、腭心面綜合征患者，并確認母親懷孕期間無外傷史和服藥史等，就診中為NSCL±P的124名。為比較TGF2是否與唇腭裂嚴重程度相關，把患者按唇腭裂嚴重程度劃分為4組，分別為：單側(cè)唇裂包括有單側(cè)唇裂伴牙槽嵴裂和隱性唇裂(Cleft Lip, CL)、單純性腭裂(Cle

9、ft Palate only, CPO)、單側(cè)唇裂伴腭裂(unilateral Cleft Lip and Palate, UCLP)和雙側(cè)唇裂伴腭裂(bilateral Cleft Lip and Palate, BCLP)。另外，為顯示TGF2是否與唇腭裂家族史相關，把患者分成有家族史（Family History, FH）和無家族史(without Family History, WFH)兩組。隨機選取哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院體檢的103名健康人為對照組(controls, C)，且家族中無唇腭裂患者。在所有研究對象中均無血緣關系。1.2  基因多態(tài)性檢測1.2.1 

10、; 基因組DNA提取  抽取外周靜脈血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取DNA。1.2.2  TGF2基因分型  反應引物按Hang3設計等報道，由上海生工生物工程公司合成。TGF2 引物上游序列為：5-CGA CGA CAA CGA TGA TGC TT-3，下游序列為：5-TAC GTA CAG CAA CTC CAC TT-3。PCR括增含有多態(tài)性基因片段，在Perkin-Elemer 9600型熱循環(huán)儀上進行。反應體系為30 L，其中包括基因組DNA0.4 L，引物各1.0 L，4×dNTP1.0L,MgCl2 2.0 L,5 m

11、mol TaqDNA聚合酶0.4 L，10×緩沖液3.0 L，ddH2O2 1.2 L。PCR反應條件見表1。取PCR產(chǎn)物5 mL,進行常規(guī)聚丙烯酰胺非變性膠電泳、銀染，觀察電泳結(jié)果并保存記錄。表1  TGF2 PCR反應條件（略）1.2.3  TGF2基因型檢測1.3  數(shù)據(jù)處理  計算各組等位基因和基因型頻率，吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。X2檢驗，比較各組基因多態(tài)性差異。對TGF2各等位基因和基因型與NSCL±P進行關聯(lián)分析。2  結(jié)果2.1  TGF2  TGF2定位

12、于1q41，在3非編碼區(qū)由于含322 bp等長片段含有的ACA重復序列不同而出現(xiàn)3種等位基因4。A2為常見的等位基因，含有8個ACA重復序列，廣泛存在于病人和正常人中。A1、A3為相對異常或較不普遍的等位基因，分別含有7個、9個ACA重復序列。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖檢樣結(jié)果見圖1。各等位基因通過常規(guī)聚丙烯酰胺變性膠電泳結(jié)果見圖2。根據(jù)保存的電泳結(jié)果按CL、CPO、UCLP、BCLP及對照組劃分統(tǒng)計各等位基因的頻數(shù)及基因型結(jié)果見表2。 根據(jù)保存的電泳結(jié)果進行有無家族史的統(tǒng)計學比較，結(jié)果見表3。在TGF2的基因多態(tài)性與CL±P的關聯(lián)性分析中，將患病組（patients, P）與對照組（c

13、ontrol, C），CL/CPO與CLP，CL與CPO，UCLP與BCLP，F(xiàn)M與WFH進行配對比較，統(tǒng)計學分析結(jié)果見表4。圖1  PCR括增產(chǎn)物瓊脂糖檢樣結(jié)果略圖2  TGF2擴增產(chǎn)物經(jīng)SSCP方法電泳結(jié)果略2.2  TGF2基因多態(tài)性與NSCL±P的關系  TGF2的基因頻率在患病組與對照組比較中，X2=表2  TGF2各等位基因及基因型頻率略表3  家族性TGF2等位基因頻數(shù)及基因型頻數(shù)略表4  TGF2基因多態(tài)性與CL±P的關聯(lián)性分析略3  討論    唇

14、腭裂是人類最常見的先天性畸形之一。流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)提示NSCL±P有明顯的家族集中性。故許多學者認為非綜合征性唇腭裂的最主要的病因是遺傳因素。大約220個基因相互作用可導致NSCL±P的發(fā)生，說明NSCL±P的致病基因具有異源性，其中主基因能導致10%50%的NSCL±P發(fā)生。    在我們的研究中，挑選了TGF2來比較黃種人與白種人唇腭裂發(fā)生的基因或位點的差異，確定黃種人唇腭裂的主基因和位點，以便應用于臨床基因診斷和基因治療，最終達到降低發(fā)病率，實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育、提高民族素質(zhì)的目的。    轉(zhuǎn)移生

15、長因子2（TGF2）是控制細胞分化和增殖的多肽家族中的成員。成熟的TGF2包含112個氨基酸單體，這些單體是從含422個氨基酸的原蛋白羧基端分裂出來的5。Nishimura1運用探針技術采用PCR-SSCP和PCR-Sac I分析方法得出亞洲人、黑人、高加索人中TGF2對唇腭裂的發(fā)生有影響，還發(fā)現(xiàn)TGF2相鄰的HLX1基因可能與TGF2有協(xié)同作用影響胚胎面部正常的聯(lián)合、融合而致畸。    TGF2在正常人與患病組之間的比較中有統(tǒng)計學意義，與Atsuko等2的報道研究一致，與Andrew C等6的不一致，可能由于人種群體不同或我們的對照組正常例數(shù)相對較多與患病組例數(shù)

16、相對均衡而致。同樣在唇裂或腭裂單發(fā)者與并發(fā)者比較中有明顯統(tǒng)計學意義，提示序列多態(tài)性與疾病嚴重程度有正相關關系，這又與后面單側(cè)唇裂并發(fā)腭裂與雙側(cè)唇裂并發(fā)腭裂相比較的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)背道而馳，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能有3個：1）樣本數(shù)量有限，僅對124名患者進行比較，有一定誤差；2）選取對象不同，主要集中在北方地區(qū)，覆蓋面不夠廣泛；3）不同于其他人的實驗設計方案也會導致這樣的陰性結(jié)果，西方人往往進行大量的家系性研究。在家族史有無的比較中，也呈現(xiàn)陰性結(jié)果，其主要原因是家系提供的研究血樣有限，家族病史的例數(shù)有限。    TGF族包括TGF1、TGF2、TGF3，其中任何一個成員缺失，

17、其他基因在某種程度上會代償這種缺失，但不可能完全代償。因此，我們提出 TGF2的某種多態(tài)性與其他因素互相影響最終導致唇腭裂發(fā)生。NSCL±P的發(fā)生還與藥物、化學物質(zhì)、物理因素、環(huán)境、感染因素等有關，作為基因遺傳病在同時存在其他諸多因素的情況下會使個體更加易感。參考文獻1    Nishimura DY, Purchio AF, Murray JC, et al. Linkage localization of TGFB2 and the human homeobox gene HLX1 to chromosome 1q J. Genetics, 1993

18、,15357-3642  Ausuko Tanabe, Shigeru Taketani, Yoko Endo-Ichikawa, et al. Analysis of the candidate genes responsible for non-syndromic cleft lip and palate in Japanese people J. Clinical Science,2000,99105-1113  Andew C Lidral, Jefferey C Murray, Kenneth H.Buetow, et al. Studies of the candidate genes TGFB2,MSX1,TGFA and TGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the Philippines J. Genetics,1996311-3164  Field LL, Ray AK, Cooper ME, et al. Genome scan for loci involved in nonsyndromic cleft lip with or without cleft pala