反相高效液相色譜法測定關節(jié)克痹丸中大黃素的含量(一)

1、反相高效液相色譜法測定關節(jié)克痹丸中大黃素的含量(一)    【關鍵詞】 反相高效液相色譜法；,關節(jié)克痹丸；,大黃素摘要：目的建立反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定關節(jié)克痹丸中大黃素的含量。方法采用Zobax C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 m），以甲醇0.1%磷酸溶液（7030）為流動相，流速1.0 ml/min，檢測波長282 nm，柱溫40。結(jié)果大黃素在0.010.2 mg/ml范圍內(nèi)線性關系良好（r=0.999 9），平均回收率為97.56%，RSD為1.51%。結(jié)論 該法操作簡便，結(jié)果準確、可靠，可作為關節(jié)克痹丸的質(zhì)

2、量控制標準之一。關鍵詞：反相高效液相色譜法； 關節(jié)克痹丸； 大黃素Determination of Emodin in Guanjiekebi Pill by RP-HPLCAbstract：ObjectiveAn RP-HPLC method was established for the determination of emodin content in Guanjiekebi pill.MethodsZobax C18(4.6 mm×150 mm，5 m) was used with a mobile phase consisted of methanol-0.1% phos

3、phoric acid(7030).The detection wavelength was 282 nm,the flow rate was 1.0 ml/min,and the temperature of the column was 40.ResultsThe linear range of emodin was 0.010.2 mg/ml(r=0.999 9),while the average recovery was 97.56%(RSD=1.51%).ConclusionThe method is simple,sensitive and accurate.It can be

4、applied in quality control of Guanjiekebi pill.Key words：RP-HPLC; Guanjiekebi pill; Emodin 關節(jié)克痹丸由川烏（制）、草烏（制）、虎杖、獨活、秦艽、麻黃等15味中藥組成，具有祛風散寒、活絡止痛功效1。臨床主要用于關節(jié)炎，四肢酸痛，伸展不利。其質(zhì)量標準中缺少含量測定方法。本文采用反相高效液相色譜法2測定該中成藥虎杖中大黃素的含量?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。1 儀器與材料1.1 儀器Agilent 1100 LC系統(tǒng)（美國惠普公司）：四元泵、在線真空脫氣機、可變波長紫外檢測器（VWD）、Agilent ChemStat

5、ion 工作站；FA2004電子分析天平（上海天平儀器廠）、BP211D電子分析天平（德國Starforias公司）；HS2005D超聲波洗滌器（天津鑫洲科技公司）。所用儀器和量具均經(jīng)校正和檢定。1.2 材料大黃素對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號110756200110）；關節(jié)克痹丸及其空白制劑（江蘇天士力制藥有限公司提供）；甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件色譜柱為Zobax C18(4.6 mm×150 mm，5 m)；流動相為甲醇0.1%磷酸溶液（7030）；檢測波長 282 nm；柱溫40；流速1.0 ml/min；進樣量10 l（

6、定量環(huán)）。2.2 溶液的制備2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的大黃素對照品11.02 mg，置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.110 2 mg/ml的對照品溶液。2.2.2 供試品溶液的制備取樣品3 g，研細，精密稱定，置250 ml具塞三角瓶中，精密加入甲醇100 ml，密塞，稱定重量，置水浴加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸收續(xù)濾液50 ml置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加5 mol/L鹽酸30 ml及氯仿30 ml，水

7、浴加熱回流30 min，冷卻，移至分液漏斗中，用少量氯仿洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿液，酸液再用氯仿提取4次，20 ml/次。合并氯仿液，蒸干，并轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 m的濾膜濾過，作為供試品溶液。2.3 標準曲線3精密稱取以五氧化二磷為干燥劑減壓干燥24 h的大黃素對照品10 mg置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。用甲醇配成濃度為：0.01，0.02，0.05，0.10，0.15，0.20 mg/ml的標準液，按上述色譜條件分別進樣10l，測定峰面積。以對照品濃度（mg/ml）為橫坐標（C），峰面積為縱坐標（A）繪制標準曲線，

8、得大黃素的回歸方程為：A=10.439 02+51 608.214 27C (r=0.999 9)；大黃素濃度在0.010.2 mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關系。2.4 精密度實驗取濃度為0.1 mg/ml的對照品溶液在上述色譜條件下重復進樣5次，10 l/次，測定峰面積，結(jié)果RSD為0.15%（n=5）。2.5 穩(wěn)定性實驗取同一樣品溶液分別于0，0.5，1，3，5，8 h進樣測定峰面積，結(jié)果RSD為0.4%(n=6)，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定。2.6 重復性實驗取同一樣品（批號 0601002）6份，分別精密稱定，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測定，計算含量，RSD為1.36%。2.7 加

9、樣回收率實驗精密稱取已知含量的樣品（0.746 6 mg/g）適量，分別精密加入大黃素對照品（0.204 6 mg/ml）5 ml，按上述供試品溶液制備方法和色譜條件測定，測得平均回收率為97.56%，RSD為1.51%。結(jié)果見表1。表1 加樣回收實驗結(jié)果（略）2.8 空白干擾實驗取空白制劑按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 l，進樣，記錄色譜圖。從圖中可見，大黃素色譜峰峰形對稱，供試品色譜圖中大黃素峰能與其它成分很好地分離，陰性供試品在大黃素峰處基本無干擾，色譜圖清晰。結(jié)果見圖13。圖1 大黃素對照品色譜圖（略）圖2 供試品色譜圖（略）

10、圖3 陰性對照品色譜圖（略）2.9 樣品含量測定按2.2.2項下操作分別對3批樣品按上述含量測定方法進行測定，計算含量。結(jié)果見表2。表2 樣品含量測定結(jié)果（略）3 小結(jié)3.1 指標性成分的確定關節(jié)克痹丸處方中虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zuce.的干燥塊根，有祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰的作用。其主要成分之一為蒽醌類化合物大黃素（Emodin）。大黃素一般以游離型和結(jié)合型兩種形式存在，生產(chǎn)過程中往往會造成部分結(jié)合型大黃素水解，因此測定中成藥水解后大黃素總量作為質(zhì)量控制指標較為合理。3.2 水解酸的選擇在供試品制備中，水解酸試用過鹽酸和硫酸液，但硫

11、酸液使氯仿液蒸干后有棕黑色殘渣，而鹽酸無此現(xiàn)象，確定用鹽酸作為水解液。3.3 提取條件的優(yōu)選為能從樣品中最大限度地提取大黃素，比較用氯仿回流與超聲提取，回流提取含量明顯高于超聲提取。結(jié)果確定提取條件為回流提取， 并且確定氯仿用量為30 ml，時間為30 min。3.4 檢測波長的選擇取大黃素對照品溶液，通過紫外掃描，檢測波長在282 nm處吸光度最強，本文選擇在282 nm處測定大黃素含量，結(jié)果比較理想，峰形較好，干擾較少。3.5 流動相的選擇對流動相配比進行了考察，當配比在7030時，色譜峰峰形對稱，且能與其它成分很好地分離。3.6 質(zhì)量控制用HPLC法測定虎杖中大黃素的含量，制劑的前處理簡便，可操作性