川芎嗪對再生障礙性貧血小鼠骨髓細(xì)胞粘附分子作用研究(精)

1、川芎嗪對再生障礙性貧血小鼠骨髓細(xì)胞 粘附分子作用研究【摘要】目的 探討免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血(再障)小鼠骨髓細(xì)胞粘附分子表達(dá)及川芎嗪對其影響。方法 建立免疫介導(dǎo)的再障小鼠模型，腹腔注射磷酸川芎嗪注射液，每次5 mg,每日2次,第14天用流式細(xì)胞儀檢測小鼠骨 髓單個核細(xì)胞CD9d、CDfee的表達(dá)水平，用免疫組織化學(xué)SABC方法檢測骨髓基質(zhì) 細(xì)胞VCAM-啲表達(dá)。結(jié)果 27只BALB/c小鼠，平均分為3組。再障組CDfed、 CD9e、VCAM-1的表達(dá)均顯著低于正常組(t=11.96,17.18 和7.09 ； P均0.001), 而川芎嗪組其表達(dá)均顯著高于再障組(t=9.05,14.61 和

2、6.91 ； P均0.001),且 CD9e和VCAM-1已近正常。結(jié)論川芎嗪能增強(qiáng)免疫介導(dǎo)再障小鼠骨髓造血細(xì)胞 和基質(zhì)細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，有利于造血細(xì)胞的增生。【關(guān)鍵詞】貧血，再生障礙性 胞間粘附分子 造血系統(tǒng) 川芎嗪Study on the effect of ligustraz ine on adhere nt moleculeexp ressi on of bone marrow cells in immun e-mediated ap lastican emia miceDONG Li ngli,LIU Wen li,SUN Han yi ng,et al.De partme nt

3、of In ternalMedici ne, Tongji Hos pital,To ngji Medical Un iversity,Wuha n430030【Abstract 】 Objective To explore the effect of ligustrazine on the exp ressi on of adhere nt molecule of bone marrow cells in immune- mediated ap lastic an emia(AA) mice.Methods Each immun e-mediated AAmouse was in tra p

4、erit on eally injected with 5 mg ligustraz ine twice a day. On the 14th day,ex pressi ons of CD 49d and CD49e in bone marrow mononu clear cells(MNC) were detected by flow cytometry,a nd VCAM-1 on stromal cells by immuno histochemistry SABC. ResultsExp ressi ons ofCD9d,CD49e and VCAM-1 were sig nific

5、a ntly lower in AA group than in normal grou p(t=11.96,17.18 and 7.09 res pectively, Pv0.001),a nd were much higher in ligustraz ine treated group tha n in non-treated grou p(t=9.05,14.61 and 6.91 res pctively, Pv0.001).Ex pressio ns of CD49dand VCAM-1 were in the no rmal range in ligustraz ine grou

6、p.Con clusi onsLigustraz ine can in crease the exp ressi on of adhere nt molecule of bone marrow cells in immun e-mediated AA mice,thus p romote the growth of hemat opo ietic cells.【Key words 】 Anemia,aplastiC InterCellular adhesion moleCule Hematopoietic system Ligustrazine造血干細(xì)胞的增殖和分化高度依賴骨髓微環(huán)境產(chǎn)生的調(diào)節(jié)

7、分子的相互作用 其中 , 造血干細(xì)胞的粘附受體與基質(zhì)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)上的粘附配體起關(guān)鍵作用 1。為此, 我們研究了免疫介導(dǎo)再生障礙性貧血 (再障)小鼠骨髓造血細(xì)胞粘附 分子CD9d和CD9e及其基質(zhì)細(xì)胞上血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)的表達(dá)及川芎嗪 對其表達(dá)的影響 , 進(jìn)一步探討促進(jìn)再障骨髓恢復(fù)造血的機(jī)制和治療方法。材料和方法1實(shí)驗(yàn)動物 近交系BALB/C小鼠(H-2d,MLe)，雌性,810周齡,體重1720 g, 由武漢生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H-2d,MLS),8周齡，雌雄兼用，由中山 醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。2 藥物 磷酸川芎嗪注射液每毫升含川芎嗪 25 mg, 由

8、麗珠集團(tuán)利民制藥廠生 產(chǎn)(批號 971002)。3 試劑和儀器 大鼠抗小鼠CD9d(VLA),CD49e(VLA5),CD106(VCAM-1)單克隆抗體和 羊抗大鼠免疫球蛋白 FITC 結(jié)合抗體購自 PharMigen 公司, 流式細(xì)胞儀為 BeCton DiCkinson 公司產(chǎn)品 , SABC(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex) 購自 Boster公司，氫化可的松購自Sigma公司。4分組及處理 BALB/C小鼠27只,隨機(jī)平均分為3組。川芎嗪組：按姚軍等方 法'2'制備再障小鼠模型后即腹腔注射川芎嗪注射液,每只5 mg,每天2次,連

9、續(xù) 13天; 再障組： 按以上方法制模后即腹腔注射生理鹽水 , 每只 0.2 ml, 用法如上 ; 正常組： 未作任何處理。第 14天稱體重后觀察下述指標(biāo)。5骨髓有核細(xì)胞(BMNC計(jì)數(shù) 參照文獻(xiàn)3方法。6骨髓單個核細(xì)胞(MNC粘附分子CD9d、CD9e表達(dá)的檢測 調(diào)骨髓MN(濃度為 1X 107ml,按左連富介紹的方法'4,用流式細(xì)胞儀檢測CD9d、CD9e表達(dá)水平。7骨髓基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1表達(dá)水平的測定骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系制備與文獻(xiàn)5相同。第28天基質(zhì)形成，吸去培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，用PBS液輕輕洗3次，力卩 入丙酮4 C固定10分鐘，晾干，粘于載玻片上。免疫組織化學(xué)以 SABC方法進(jìn)

10、行DAB顯色。結(jié)果判斷：細(xì)胞膜顯棕色為陽性，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個高倍鏡(X 40)視野 中陽性細(xì)胞百分率。8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以 <"x- (851 bytes)"src="/med/cano/201003/20100317181543447" 13 15> ±s 表示，采用 t 檢驗(yàn)。結(jié)果表 1 顯示 , 再障組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù) , 骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于正常。 再 障組骨髓MNCt CDbd、CD9e表達(dá)水平明顯低于正常組(t=11.96和17.18,P均 <0.001)。川芎嗪組骨髓MNCt CD9d、CD9e表達(dá)水平顯著高于

11、再障組(t=9.05和 14.61,P均<0.001),其中CD9e的表達(dá)已達(dá)正常。川芎嗪組基質(zhì)細(xì)胞表達(dá) VCAM-1 的陽性率已近正常 , 且顯著高于再障組 (t=6.91,P<0.001) 。川芎嗪組與正常組一 樣, 基質(zhì)細(xì)胞生長濃密 , 以梭形成纖維細(xì)胞為主 ;再障組基質(zhì)細(xì)胞凋零稀疏 , 多為 圓形細(xì)胞 , 成纖維細(xì)胞的偽足不明顯。表1川芎嗪對免疫再障小鼠骨髓單個核細(xì)胞CE49d> CD9e及基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1表達(dá)的影響(<"x- (851 bytes)" src="/med/cano/201003/2010031718154344

12、7"13 15> ± s)組別鼠1WBC(X 109/L)骨髓MNCC(X1骨；根股(熒光強(qiáng)度)CDoe(熒光強(qiáng)度)VCAM-1(%)正常組96.4 ± 0.812.8 ± 1.756.55 ± 5.1454.42 ± 0. 9561.4 ± 12.1再障組9A1.5 ± 0.72.7 ± 0.6 34.50 ± 2.04 A35.27 ± 2.4828.1 ± 7.2 川芎嗪 組92.9 ± 0.7 *6.2 ± 0.4 *47.38 ±

13、 3.75 *56.19 ± 2.99*56.7 ± 10.1 *注：與正常組比較P<0.001; *與再障組比較P<0.001基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞的直接連接有傳遞轉(zhuǎn)換信息分子的作用，此種連接是通 過基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞表面的粘附分子實(shí)現(xiàn)的,細(xì)胞粘附分子VLA(VeryLate antigen)是紅系祖細(xì)胞的纖維連接蛋白(Fn)的受體，VLA 4是髓系造血祖細(xì) 胞的Fn及VCAM-1的受體。90%以上的CD；細(xì)胞，包括紅系爆式集落(BFU-E)和 粒-巨噬系集落(CFU-GM都表達(dá)VLA和VLA。VCAM-俵達(dá)于骨髓微環(huán)境網(wǎng)狀 纖維細(xì)胞和骨髓微血管內(nèi)皮細(xì)胞上。VCA

14、M-1在調(diào)節(jié)造血中有重要作用，參與造 血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞形成聚集體7,有利于造血細(xì)胞增殖、分化。本研究結(jié)果顯 示再障小鼠骨髓造血細(xì)胞粘附分子受體 VLA、VLA顯著低于正常小鼠，再障小鼠 骨髓基質(zhì)細(xì)胞上VLA的配體VCAM-1也顯著低于正常小鼠。因此，如能增強(qiáng) VLA、VLA及VCAM-1的表達(dá)，將有助于骨髓造血細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì) 的粘附,促進(jìn)造血干細(xì)胞的增生。我們曾觀察到川芎嗪通過促進(jìn)骨髓微血管的修復(fù)，增加骨髓供氧，促進(jìn)基質(zhì) 細(xì)胞生長及其粘附功能，改善骨髓微環(huán)境，增加免疫介導(dǎo)再障小鼠骨髓細(xì)胞 CD4 抗原表達(dá)宙8。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明川芎嗪顯著增強(qiáng)再障小鼠骨髓造血細(xì)胞 VLA、VLA的

15、表達(dá)，同時增加基質(zhì)細(xì)胞VCAM-1的表達(dá),說明川芎嗪不僅作用于基 質(zhì)細(xì)胞,提高粘附分子配體表達(dá)，同時作用于造血細(xì)胞，提高其粘附分子受體的表 達(dá),從而加強(qiáng)基質(zhì)細(xì)胞與造血細(xì)胞相互作用，促進(jìn)骨髓造血細(xì)胞的增生。本課題受國家自然科學(xué)基金(39670911)和湖北省自然科學(xué)基金(96J080)資助 作者單位：董凌莉 劉文勵孫漢英徐慧珍 430030武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué) 附屬同濟(jì)醫(yī)院內(nèi)科；陶德定同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院分子生物學(xué)研究室參考文獻(xiàn)1 Clulombel L, Auffray I, Gaugler MH, et al. Exp ressi on and function of in tegri n

16、s on hemat opo ietic p roge nitor cells. Acta Haematol,1997,97:13-21.2 姚軍, 李樹濃.淋巴細(xì)胞與再生障礙性貧血的實(shí)驗(yàn)研究 . 中華血液學(xué)雜志， 1991,12:229-231.3 唐佩弦, 楊天楹,主編. 造血細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) . 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社 , 1985.59-62,147-160.4 左連富 . 流式細(xì)胞術(shù)樣品制備技術(shù) . 第 1 版 . 北京: 華夏出版 社,1991.83,94-95.5 孫漢英 , 舒硯君 , 劉文勵 , 等 . 川芎嗪改善免疫誘導(dǎo)再生障礙性貧血小鼠骨髓 微環(huán)境作用的研究 . 中華血液學(xué)雜志 , 1998,19:178-180.6 Weber MC, Tykocinski ML. Bone marrow stromal cell blockade of human leukemic cell differentiation. Blood, 1994,83:2221-2229.7 Oostendorp RA, Reisbach G, Spitzer E, et al.