聚蛋白多糖酶與骨關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展

1、聚蛋白多糖酶與骨關(guān)節(jié)炎研究進(jìn)展 08-06-27 15:29:00 作者：閆新峰，湯繼文編輯：studa20【關(guān)鍵詞】 聚蛋白 骨關(guān)節(jié)炎 軟骨細(xì)胞合成和降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）大分子，而基質(zhì)又可維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和軟骨結(jié)構(gòu)。骨關(guān)節(jié)炎（OA）疾病的主要病理特點(diǎn)是ECM的降解超過其合成，引起軟骨基質(zhì)凈含量的減少，覆蓋關(guān)節(jié)骨表面的軟骨甚至可完全耗損。其中ECM的重要成分聚蛋白多糖的丟失被認(rèn)為是關(guān)節(jié)炎的主要早期表現(xiàn)，最初發(fā)生于關(guān)節(jié)表面，以后進(jìn)展至深區(qū)，隨后出現(xiàn)膠原纖維降解和組織力學(xué)障礙。引起軟骨降解的原因有很多，但該過程最主要的原因是蛋白水解酶活性增高?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）曾被認(rèn)為是降解軟

2、骨聚蛋白多糖和膠原的主要酶類1。而最近發(fā)現(xiàn)的一組被稱作“聚蛋白多糖酶（Aggrecanase）”的帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTS）家族成員被認(rèn)為在OA的發(fā)病過程中有更重要的作用。本文對(duì)聚蛋白多糖酶在OA發(fā)病過程中的作用研究綜述如下。 1 聚蛋白多糖酶的發(fā)現(xiàn) 已有研究證實(shí)，MMPs是在聚蛋白多糖核心蛋白的球間區(qū)（IGD）Asn341Phe342位點(diǎn)裂解聚蛋白多糖2（圖1），產(chǎn)生的聚蛋白多糖片段分別為G1DIPEN和FFG。然而，1991

3、年Sandy等3報(bào)道，用炎性細(xì)胞因子IL1處理牛關(guān)節(jié)軟骨可誘發(fā)軟骨降解，聚蛋白多糖的裂解發(fā)生于IGD的Glu373Ala374位點(diǎn)，產(chǎn)生的聚蛋白多糖片段是G1NITEGE和APG。這種新的具有蛋白水解活性的酶被稱作“聚蛋白多糖酶”。在Glu373Ala374位點(diǎn)切割產(chǎn)生的聚蛋白多糖片斷積聚在OA及炎性關(guān)節(jié)炎患者的滑液中4，表明聚蛋白多糖酶在體內(nèi)的潛在重要性。 圖1聚蛋白多糖的結(jié)構(gòu)和酶切位點(diǎn) 盡管自1991年以來人們便考慮有“聚蛋白多糖酶”的存在，但是直到1999年科學(xué)雜志才報(bào)道了第1個(gè)克隆純化的聚蛋白多糖酶，即Aggrecanase15，隨后同一研究小組又報(bào)道了第2個(gè)聚蛋白多糖酶ADAMTS1

4、1（Aggrecanase2）6。聚蛋白多糖酶1和2，現(xiàn)在分別被命名為ADAMTS4和ADAMTS5。它們?yōu)楹袖\的金屬蛋白酶，其結(jié)構(gòu)和序列的排列與ADAMTS具有同源性。在對(duì)ADAMTS家族的其他成員進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，ADAMTS1和ADAMTS8也具有聚蛋白多糖酶活性，在軟骨中也可見到它們的表達(dá)7、8。但是由于ADAMTS1和ADAMTS8的作用比較弱，因此被公認(rèn)的聚蛋白多糖酶只有2個(gè)：ADAMTS4和ADAMTS5（也被稱為ADAMTS11）。 2 聚蛋白多糖酶在骨關(guān)節(jié)炎中的作用 在OA軟骨中ADAMTS4和ADAMTS5均明顯增多9。OA關(guān)節(jié)中也有ADAMTS4和ADAMTS5的基因表達(dá)

5、，而且ADAMTS4 mRNA在OA軟骨中的表達(dá)明顯上調(diào)10。OA軟骨及滑液中有較多的聚蛋白多糖酶產(chǎn)生的聚蛋白多糖裂解片斷4。但是由于OA軟骨11和滑液4中同時(shí)也存在MMPs產(chǎn)生的聚蛋白多糖片斷，所以在生理和病理情況下究竟哪一組酶對(duì)聚蛋白多糖的降解起主要作用一直是近年來人們討論的熱點(diǎn)。 G1VDIPEN和G1NITEGE片斷均可保持與透明質(zhì)酸的連接存留在軟骨中，用識(shí)別各自片段羧基端新抗原表位的抗體可對(duì)這2種片斷進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用該方法研究發(fā)現(xiàn)，在正常人軟骨，2種新的抗原表位均可見，并隨著年齡的增長(zhǎng)而增加11。在大多OA軟骨中，2種新抗原表位的分布類似，說明MMPs和聚蛋白多糖酶在軟骨破壞的病理過程

6、中同樣起作用，而在某些OA病例中，在無G1VDIPEN的部位仍可檢測(cè)到G1NITEGE新抗原表位12，這雖然不能說明聚蛋白多糖酶的作用更強(qiáng)，但表明2種酶可在軟骨的不同部位發(fā)揮作用，而且聚蛋白多糖酶的作用部位可能更多。 有研究發(fā)現(xiàn)，正常成人軟骨至少包括7種含有G1區(qū)的聚蛋白多糖類型13，分別為：全長(zhǎng)聚蛋白多糖、G1NITEGE373、G1VDIPEN341片斷，以及其他4種去糖基化后分別為89.289、109.131、158.736 ku和248.025 ku的片段。后4種片段在體內(nèi)很可能由MMPs生成。然而，核心蛋白的構(gòu)成在OA軟骨中并未改變，相反，滑液中則含有較多的由聚蛋白多糖酶產(chǎn)生的片斷，

7、在急性損傷關(guān)節(jié)的軟骨和滑液中，聚蛋白多糖酶產(chǎn)生的G1NITEGE與MMPs產(chǎn)生的G1VDIPEN的比值明顯增高。在這些觀察發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，研究者提出聚蛋白多糖酶活性過高對(duì)軟骨基質(zhì)具有破壞作用，而MMP活性無破壞性，因?yàn)镸MP主要修剪聚蛋白多糖分子的C末端區(qū)域，且其產(chǎn)生的含有GAG的片斷大多存留于組織中，在維持軟骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起一定作用。由于被MMP裂解的IGD不再對(duì)聚蛋白多糖酶敏感14，因此這些片斷能抵抗聚蛋白多糖酶進(jìn)一步破壞。 在短期體外軟骨培養(yǎng)模型中，受IL1、TNF或維甲酸刺激后，至少在最初幾周，聚蛋白多糖酶表現(xiàn)為降解聚蛋白多糖的主要酶，雖然MMP3和MMP13 mRNA表達(dá)增高，但MMPs

8、幾乎不起作用，大約培養(yǎng)3周后，可檢測(cè)到MMP依賴的聚蛋白多糖核心蛋白的降解，此時(shí)膠原的降解也開始發(fā)生15。盡管有報(bào)道用IL1或維甲酸處理豬軟骨，5 d后軟骨中MMP產(chǎn)生的聚蛋白多糖片斷增多，但在隨后便被指出這只是一個(gè)實(shí)驗(yàn)假象16。這樣，在體外軟骨培養(yǎng)體系中，最初降解聚蛋白多糖的酶是聚蛋白多糖酶，而在后期階段MMPs才發(fā)揮作用15。 用關(guān)節(jié)炎模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚蛋白多糖和MMP都參與了軟骨降解。在抗原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎鼠模型中聚蛋白多糖缺失的早期階段，僅存在NITEGE新抗原表位（聚蛋白多糖產(chǎn)生），不存在VDIPEN抗原表位（MMP產(chǎn)生），當(dāng)聚蛋白多糖降解進(jìn)一步發(fā)展時(shí)，可檢測(cè)到VDIPEN抗原表位，與此同

9、時(shí)，膠原酶開始裂解型膠原17，也說明MMP僅在OA的后期才起作用。 應(yīng)用基因敲除技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在MMP3基因敲除小鼠的抗原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎軟骨中，既不出現(xiàn)VDIPEN抗原表位，也沒有膠原酶裂解的新抗原出現(xiàn)，而MMP3（-）和野生型小鼠其蛋白多糖缺失的程度相同，故聚蛋白多糖降解的媒介可能是聚蛋白多糖酶；在更嚴(yán)重的膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型中，MMP3（-）小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)展的程度與野生型的類似18。也就是說，盡管在MMP家族中MMP3分解ECM能力最強(qiáng)，但是其基因敲除后并不能阻止OA的發(fā)生。而Glasson等19發(fā)現(xiàn)，小鼠ADAMTS5（聚蛋白多糖酶2）基因敲除后，OA的發(fā)生程度明顯減輕，可以抑制OA的發(fā)生和發(fā)展

10、。Stanton等20也發(fā)現(xiàn)ADAMTS5是小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中軟骨降解的主要酶，但是還不知道這種結(jié)果在人軟骨中是否一樣。 3 聚蛋白多糖酶表達(dá)的調(diào)節(jié) 在蛋白質(zhì)水平上，ADAMTSs是以前蛋白前體的形式合成，并通過分泌途徑排出。它們可能是在細(xì)胞內(nèi)被前蛋白轉(zhuǎn)化酶活化，而以活性酶的形式分泌。成熟的全長(zhǎng)ADAMTS4（74.407 ku）還要經(jīng)過進(jìn)一步的細(xì)胞外加工，被裂解為59.526 ku和49.605 ku 2種形式。這些附加的加工過程明顯增加了聚蛋白多糖酶的活性，表明翻譯后加工是該酶在體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)機(jī)理21。 ADAMTSs的蛋白水解活性具有高度選擇性。這些酶的高度選擇的特異性取決于它們的非催

11、化序列，多糖鏈與酶的相互作用對(duì)聚蛋白多糖酶的活性至關(guān)重要。C末端有13個(gè)殘基（P殘基）對(duì)聚蛋白多糖酶在Glu373Ala374位點(diǎn)裂解聚蛋白多糖是必不可少的22。被MMP降解的IGD不再對(duì)聚蛋白多糖酶敏感，而聚蛋白多糖酶裂解的IGD仍可被MMPs在Asn341Phe342位點(diǎn)水解14。不僅是IGD的初級(jí)結(jié)構(gòu)，其次級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)聚蛋白多糖酶識(shí)別底物也是必需的。 在基因水平上，有關(guān)誘導(dǎo)性刺激物對(duì)聚蛋白多糖酶mRNA表達(dá)的影響的報(bào)道差別很大。例如：用IL1、TNTa或維甲酸處理培養(yǎng)的正常人軟骨，可增加聚蛋白多糖酶活性，但不影響ADAMTS1、ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表達(dá)23，提示聚蛋白多

12、糖酶活性的增加可能是經(jīng)過翻譯后調(diào)節(jié)或由尚未確認(rèn)的聚蛋白多糖酶所致。另有報(bào)道，人軟骨細(xì)胞經(jīng)IL1刺激后，可增加ADAMTS4 mRNA的表達(dá)24。還有報(bào)道在永生化人軟骨細(xì)胞中，IL1和制瘤素M共同作用可增加ADAMTS4 mRNA的表達(dá)，而其中任一種細(xì)胞因子單獨(dú)作用則無此影響25。 牛軟骨細(xì)胞和牛關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)IL1刺激后，均可增加ADAMTS4 mRNA的表達(dá)26，聚蛋白多糖酶的活性也明顯增強(qiáng)3。 有幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，IL1對(duì)ADAMTS5 mRNA的表達(dá)沒有或僅有輕微影響24、26。另有研究報(bào)道，IL1可增加豬關(guān)節(jié)軟骨27和永生化人軟骨細(xì)胞中ADAMTS5 mRNA的表達(dá)25。還有研究顯示IL18可

13、以上調(diào)人軟骨的ADAMTS5 mRNA的表達(dá)，但對(duì)ADAMTS4 mRNA的表達(dá)則沒有明顯影響28。 這些報(bào)道的差異和矛盾表明，ADAMTS4和ADAMTS5轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)機(jī)理依賴于所研究的物種、組織年齡和分離細(xì)胞的培養(yǎng)狀況。mRNA的穩(wěn)定性和半衰期也會(huì)影響結(jié)果。 聚蛋白多糖酶mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)還與細(xì)胞類型有關(guān)。盡管牛軟骨細(xì)胞和牛關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)IL1刺激后，均可增加ADAMTS4 mRNA的表達(dá)26，但用IL1或維甲酸處理牛滑膜，并不改變ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表達(dá)29。用IL1或TNF處理人滑膜細(xì)胞也不改變ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA的表達(dá)10。 可以下調(diào)聚蛋白多糖

14、酶mRNA的有環(huán)孢菌素A和n3脂肪酸。用環(huán)孢菌素A處理豬關(guān)節(jié)軟骨，可去除IL1誘導(dǎo)的ADAMTS4和ADAMTS5 mRNA表達(dá)的增加27。給牛軟骨細(xì)胞補(bǔ)充n3脂肪酸，可降低IL1誘導(dǎo)的ADAMTS4的mRNA表達(dá)，但不影響ADAMTS5的表達(dá)30。用n3脂肪酸處理人OA軟骨，也具有類似的對(duì)ADAMTS4 mRNA表達(dá)的抑制作用，同時(shí)伴有軟骨聚蛋白多糖酶活性的降低31。迄今為止n3脂肪酸和環(huán)孢菌素A對(duì)這些基因的調(diào)節(jié)機(jī)理還不清楚。 4 聚蛋白多糖酶抑制劑 TIMP3是聚蛋白多糖酶的內(nèi)源性抑制劑。TIMPs通常被認(rèn)為是MMPs的特異性抑制劑，但TIMP3較特殊，人TIMP3的重組N末端抑制序列可抑

15、制ADAMTS4和ADAMTS5，其抑制常數(shù)（Ki值）低于納摩爾，明顯小于對(duì)MMPs抑制所需濃度，表明TIMP3是聚蛋白多糖酶1和2的強(qiáng)大內(nèi)源性抑制劑32。 因聚蛋白多糖酶的克隆純化時(shí)間不長(zhǎng)，因此其合成抑制劑的研究也較少。除了n3脂肪酸和環(huán)孢菌素A可以下調(diào)聚蛋白多糖酶mRNA以外，一種琥珀酸氧肟酸化合物含有3羥苯基和cis（1S）（2R）氨基2茚醇，對(duì)聚蛋白多糖酶有較好的選擇性，并且口服有效33。另幾種在P1部位有二苯基苯酚的化合物，對(duì)聚蛋白多糖酶的抑制能力則更強(qiáng)，其IC50在很低的納摩爾范圍34，而且這幾種化合物對(duì)MMP1和MMP9也有很好的抑制能力。 綜上所述，在OA軟骨和滑液中均可見聚蛋白多糖酶產(chǎn)生的聚蛋白多糖產(chǎn)物，表明它們參與了軟骨聚蛋白多糖的分解代謝，因?yàn)樗鼈兪亲罱疟话l(fā)現(xiàn)的一組酶，有關(guān)其生理及病理意義的認(rèn)識(shí)還很有限，其在體內(nèi)軟骨降解中發(fā)揮的作用及其作用