犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)定量檢測試劑盒(ELISA)

1、本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷。犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）定量檢測試劑盒（ELISA）使用說明書【試劑盒名稱】犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）定量檢測試劑盒（ELISA）【試劑盒用途】定量檢測犬血清、血漿及相關(guān)液體樣本中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的含量?！緳z測原理】本試劑盒采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。將標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本加入到預(yù)先包被犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）單克隆抗體透明酶標(biāo)包被板中，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分，再加入酶標(biāo)工作液，溫育足夠時間后，洗滌除去未結(jié)合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根過氧化物酶（HRP）催化下轉(zhuǎn)化

2、為藍色產(chǎn)物，在酸的作用下變成黃色，顏色的深淺與樣品中犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）濃度呈正相關(guān)，450nm波長下測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值，計算樣本中犬神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）含量?！驹噭┖薪M成】1酶標(biāo)包被板12孔8條7顯色劑A液6mL2標(biāo)準(zhǔn)品：80ng/mL0.6mL8顯色劑B液6mL320倍濃縮洗滌液25mL9終止液6mL4標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液6mL10說明書1份5樣本稀釋液6mL11封板膜2張6酶標(biāo)試劑6mL12密封袋1個備注：標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液依次稀釋為：80、40、20、10、5、2.5ng/mL【需要而未提供的試劑和器材】1、37恒溫箱2、 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀3、 精密移液

3、器及一次性吸頭4、 蒸餾水5、 一次性試管6、 吸水紙【操作步驟】1、準(zhǔn)備：從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。2、配液：用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。3、加標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本：取足夠數(shù)量的酶標(biāo)包被板，固定于框架上，分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測樣本孔和空白對照孔，記錄各孔位置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50L；待測樣本孔中先加入待測樣本10L，再加樣本稀釋液40L（即樣本稀釋5倍）；空白對照孔不加。4、溫育：37水浴鍋或恒溫箱溫育30min。5、洗板：棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板4次（也可用洗板機按說明書操作洗板）。6、加

4、酶標(biāo)工作液：每孔加入酶標(biāo)工作液50L，空白對照孔不加。7、溫育：重復(fù)4的操作。8、洗板：重復(fù)5的操作。9、顯色：每孔先加入顯色劑A 液50L，再加入顯色劑B液 50L，37避光顯色15min。10、終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50L，終止反應(yīng)（顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11、測定：以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長測量各孔的吸光值（OD值）。12、計算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對應(yīng)的OD值，計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣本的OD值，在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度，也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。最終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)?！緲颖疽蟆?、樣本不能含疊氮鈉（NaN3），因

5、為疊氮鈉（NaN3）是辣根過氧化物酶（HRP）的抑制劑。2、標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能立即試驗，可將標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3、樣本應(yīng)充分離心，不得有溶血及顆粒?！咀⒁馐马棥?、實驗嚴(yán)格按照說明書的操作進行，實驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。2、酶標(biāo)包被板開封后如未用完，應(yīng)立即裝入密封袋中加干燥劑保存。3、建議所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照都做雙份檢測，取平均值，以減小實驗誤差。4、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍，計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度。5、本試劑盒定量范圍為2.5-80ng/mL，超過此范圍，為標(biāo)準(zhǔn)曲線延伸計算所得，不做為準(zhǔn)確定量結(jié)果，請用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋后測定準(zhǔn)確結(jié)果（2.5-80ng/mL范圍內(nèi)），乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本最終濃度。6、若顯色過淺，可適當(dāng)延長底物溫育時間。7、為避免交叉污染，標(biāo)準(zhǔn)品、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭；酶標(biāo)工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分，要懸臂加樣，不得碰到微孔；不得重復(fù)使用封板膜。8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用，不同批號的試劑不得混用。9、底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。【操作程序總結(jié)】準(zhǔn)備試劑，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37反應(yīng)30分鐘洗板4次，加入酶標(biāo)試劑，37反應(yīng)3