抗原或抗體的檢測(cè)

1、抗原或抗體的檢測(cè)一、檢測(cè)的原理借助抗原和抗體在體外特異結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，對(duì)樣品中的抗原或抗體 進(jìn)行定性、定量、定位的檢測(cè)。1抗原與抗體的親和力（affinity）抗原抗體的結(jié)合就像酶與底物的結(jié)合，激 素與其受體的結(jié)合一樣不是化學(xué)的反應(yīng)，而是非共價(jià)鍵的可逆的結(jié)合。抗原決定簇 和抗體分子可變區(qū)互補(bǔ)構(gòu)型，造成兩分子間有較強(qiáng)的親和力。空間構(gòu)型互補(bǔ)程度不 同，抗原和抗體分子之間結(jié)合力強(qiáng)弱也不同。互補(bǔ)程度高，則親和力強(qiáng)。此外，反 應(yīng)溫度、酸堿度和離子濃度對(duì)抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重 要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結(jié)合力大小可用親合力來(lái)表示。高親合力的抗 體與抗原的結(jié)合力強(qiáng)，即使抗

2、原濃度很低時(shí)也有較多的抗體結(jié)合抗原形成免疫復(fù)合 物。2抗原或抗體外檢測(cè)原理根據(jù)抗原抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物的性狀與活性特 點(diǎn)，對(duì)標(biāo)本中的抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。定性和定位檢測(cè)比較簡(jiǎn) 單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，若有免疫復(fù)合物形成的現(xiàn)象 發(fā)生，就說(shuō)明待檢樣品中有相應(yīng)的抗原存在。若無(wú)預(yù)期的現(xiàn)象發(fā)生，則說(shuō)明樣品中 無(wú)相應(yīng)的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測(cè)樣品中是否有相應(yīng)抗體。對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量檢測(cè)時(shí)， 以反應(yīng)中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫 復(fù)物的濃度呈函數(shù)關(guān)系。（1）根據(jù)免疫復(fù)合物產(chǎn)生的多少來(lái)推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一 定的反應(yīng)條件下，加入的已知抗體（

3、或抗原）的濃度一定，反應(yīng)產(chǎn)生的免疫復(fù)合物 多少與待檢樣品中含有相應(yīng)抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時(shí)，免 疫復(fù)合物越多則樣品中的抗原量也越多?？捎脤?shí)驗(yàn)性標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫比濁試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫檢測(cè)等都屬于 這類方法。（2）抗原或抗體效價(jià)滴定的原理：當(dāng)抗原抗體復(fù)合物形成多少不能反應(yīng)抗原 抗體反應(yīng)強(qiáng)弱時(shí)，就不能以檢測(cè)反應(yīng)強(qiáng)度來(lái)對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量。在實(shí)際工作 中，把濃度低的反應(yīng)成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另一種反應(yīng)成分 作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產(chǎn)生抗體的多 少，即滴定3只兔血清抗體效價(jià)，可用雙向瓊脂

4、擴(kuò)散法來(lái)滴定，例如將抗體濃度固 定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應(yīng)小孔中，觀察免疫 兔血清與不同稀釋度的抗原出現(xiàn)明顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價(jià)為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產(chǎn)生抗體的效價(jià)要高）。也就 是表示效價(jià)的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清（抗原）和抗體 （免疫兔血清）相比，濃度高，故應(yīng)稀釋抗原。二、抗原或抗體檢測(cè)的實(shí)用意義1抗體檢測(cè)的意義檢測(cè)抗體可用于評(píng)價(jià)人和動(dòng)物免疫功能的指標(biāo)?？贵w用于 臨床治療或?qū)嶒?yàn)研究時(shí)也需做純度分析和定量測(cè)定。臨床上檢測(cè)病人的抗病原生物 的抗體、抗過(guò)敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各

5、種自身抗體，對(duì)有關(guān) 疾病的診斷有重要意義。2抗原檢測(cè)的意義可做為抗原進(jìn)行檢測(cè)的物質(zhì)可分為以下四類：（1）各種微生物及其大分子產(chǎn)物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以 及對(duì)菌苗、疫苗的研究。（2）生物體內(nèi)各種大分子物質(zhì)：包括各種血清蛋白（如各類免疫球蛋白、補(bǔ) 體的各種成分）、可溶性血型物質(zhì)、多肽類激素、細(xì)胞因子及癌胚抗原等均可做為 抗原進(jìn)行檢測(cè)。在對(duì)這些成分的生物學(xué)作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意 義。(3)人和動(dòng)物細(xì)胞的表面分子：包括細(xì)胞表面各種分化抗原(如CD抗原)、同種異型抗原(血型抗原或MHC抗原)、病毒相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)性情抗原 等。檢測(cè)這些抗原對(duì)各種細(xì)胞的分類、分化過(guò)程及功能研

6、究、對(duì)各種與免疫有關(guān)的 疾病的診斷及發(fā)病機(jī)制的研究，均有重要意義。(4)各種半抗原物質(zhì)：某些藥物、激素和炎癥介質(zhì)等屬于小分子的半抗原， 可以分別將它們偶聯(lián)到大分子的載體上，組成人工結(jié)合的完全抗原。用其免疫動(dòng) 物，制備出各種半抗原的抗體，應(yīng)用于各種半抗原物質(zhì)的檢測(cè)，例如對(duì)某些病人在 服用藥物后進(jìn)行血中藥物濃度的監(jiān)測(cè)。對(duì)運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行服用違禁藥品的檢測(cè)，都是應(yīng) 用半抗原檢測(cè)的方法。三、抗原或抗體檢測(cè)的方法由于各種檢測(cè)方法中所用的抗原性狀不同，出現(xiàn)結(jié)果的現(xiàn)象也不同。最廣泛 應(yīng)用方法有下述幾種：(一)沉淀反應(yīng)可溶性抗原與抗體結(jié)合，在兩者比例合適時(shí)，可形成較大的不溶性免疫復(fù)合 物。在反應(yīng)體系中出現(xiàn)不透明的沉

7、淀物，這種抗原抗體反應(yīng)稱為沉淀反應(yīng)(precipitation neaction)。1環(huán)狀沉淀試驗(yàn)先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面 相遇，形成白色免疫復(fù)合物沉淀環(huán)，故名為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)(ring precipitationtest),此法簡(jiǎn)便易行，需用材料較多是其缺點(diǎn)。2單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(single immunodiffusion)是在凝 膠中進(jìn)行的沉淀反應(yīng)。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗 體的瓊脂板，在適當(dāng)位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內(nèi)，讓抗原從小孔向

8、四周的瓊脂中擴(kuò)散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復(fù)合物。當(dāng)復(fù)合物體積增加到一 定程度時(shí)停止擴(kuò)散，出現(xiàn)以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原 濃度成正相關(guān)。本方法簡(jiǎn)便，易于觀察結(jié)果，可測(cè)定抗原的靈敏度(最低濃度)約 為1020卩g/ml，常用于定量測(cè)定人或動(dòng)物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點(diǎn) 是需12天才能看結(jié)果(圖1)圖1單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖3免疫比濁法 當(dāng)抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼 看不見(jiàn)的小免疫復(fù)合物，它可使通過(guò)液體的光束發(fā)生散射，隨著加入抗原增多，形 成的免疫復(fù)合物也增多，光散射現(xiàn)象也相應(yīng)加強(qiáng)。免疫比濁法(immu non ephelomytry

9、)就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經(jīng)過(guò)一 段時(shí)間，用光散射濁度計(jì)(nephelometry)測(cè)量反應(yīng)液體的濁度，來(lái)推算樣品中的 抗原含量。本法敏感、快速簡(jiǎn)便，可取代單向擴(kuò)散法定量測(cè)定免疫球蛋白的濃度。4，雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)雙免疫擴(kuò)散試驗(yàn)(double immunodiffusion)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔，在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗 原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)23條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)，或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析(圖2)。AfilA*；o oex0/0w、aAbl.bl ME圖2雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖5.對(duì)流免疫

10、電泳 對(duì)流電泳(counterimmunoelectrophoresis)是一敏感快 速的檢測(cè)方法，即在電場(chǎng)作用下的雙向免疫擴(kuò)散。將瓊脂板放入電泳槽內(nèi)，使瓊脂 板的兩孔沿著電場(chǎng)的方向，于負(fù)極側(cè)的孔內(nèi)加入抗原，于正極側(cè)的孔內(nèi)加入抗體， 通電后，抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，抗體分子雖也帶負(fù)電荷，但因分子量大，向正 極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負(fù)極移動(dòng)，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復(fù)合物的沉淀線。只需1小時(shí)左右即可觀察結(jié)果。6.免疫電泳免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個(gè)步驟，即 先進(jìn)行電泳，再進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電

11、泳速度不同而分散開(kāi)。然后在適當(dāng)?shù)奈恢蒙涎仉娪痉较蛲谝恢本€形槽，于槽內(nèi)加入含有 針對(duì)各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫擴(kuò)散，可形成多 答卷沉淀線。常用此法進(jìn)行血清的蛋白種類分析。對(duì)于免疫球蛋白缺損或增多的疾 病的診斷或鑒別診斷有重要意義(圖3)。原開(kāi)小幾內(nèi)加人詩(shī)檯恥漕ilAfctlgC4. .+ _+ -t 1*1圖3免疫電泳法基本步示決圖7.免疫印跡法免疫印跡法（immunoblotting）又稱為Western印跡法，用于AIDS的血清抗體檢測(cè)。第一步，為電泳分離HIV抗原，在電場(chǎng)中根據(jù)分子量大小不同病毒抗原各成分散開(kāi)。第二步，將電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上（電 印

12、跡），然后將印跡有病毒抗原的硝酸纖維膜浸濕于病人血清中。如果病人血清中 含有與一種或幾種抗原相對(duì)應(yīng)的抗體的話， 則在該抗原印跡部位形成免疫復(fù)合物沉 淀。 在洗去未沉淀的抗原和抗體后，在膜上加標(biāo)記的抗人免疫球蛋白的抗體，此抗 體可以和病毒抗原與人抗體形成的免疫復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)，最后加入顯色底物（如果 抗人Ig是用酶標(biāo)記的）或做放射自顯影（抗人Ig用1251標(biāo)記）以顯示結(jié)果（圖4）。1宅稼分離-呈掘i護(hù)影成洗人肛消:加m捉八it圖4用免疫印跡法檢查患者血清中的HIV病毒抗體第一步：經(jīng)電泳將HIV混合抗合抗原按分子量大小分離;第二步：將已分離的抗原經(jīng)電印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上；第三步：將待檢病人血清加入

13、覆蓋于硝酸纖維膜上；第四步：加入標(biāo)記的第二抗體使之覆蓋膜上;第五步：加入顯色底物(或放射自顯影)顯現(xiàn)第二抗體(二)凝集反應(yīng)細(xì)菌、紅細(xì)胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒等都是不溶性的顆?？乖?，當(dāng)與相 應(yīng)抗體結(jié)合，抗原與抗體結(jié)合形成凝集團(tuán)塊，即稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。1直接凝集直接凝集(direct agglutination)是將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生的細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象?？捎糜趥魅静≡\斷如肥達(dá)氏反應(yīng) (Widalreaction)診斷傷寒病?；蚶醚?xì)胞凝集現(xiàn)象檢查血型。2間接凝集間接凝集(indirect agglutination)是用可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t

14、細(xì)胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。如用丫球蛋白包乳膠顆粒檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中的類風(fēng)濕因子，用甲狀腺球蛋白包被乳膠顆粒 用于檢測(cè)甲狀腺球蛋的抗體。也可以將抗體吸附到乳膠顆粒上檢查臨床標(biāo)本中的抗 原，如細(xì)菌或真菌性腦膜炎抗體包被的乳顆粒， 一旦與含有相應(yīng)抗原的腦脊液混 合，便可發(fā)生凝集， 可進(jìn)行快速診斷。故凝集反應(yīng)即可測(cè)定抗原，也可測(cè)抗體，方 法簡(jiǎn)便、敏感。3抗球蛋白試驗(yàn) 抗球蛋白試驗(yàn)(antiglobulin test,coombs test)的原理 為間接凝集試驗(yàn)。例如應(yīng)用于診斷自身免疫溶血性貧血癥時(shí)，Rh+X細(xì)胞與抗Rh血清間的反應(yīng)。因抗Rh抗體是IgG只有兩個(gè)結(jié)合價(jià)，分子較小(

15、不如IgM結(jié)合價(jià) 多，分子大)很難直接引起Rh4紅細(xì)胞凝集。如果加入抗IgG的抗體，就可幫助抗Rh的IgG的抗體凝集紅細(xì)胞。也就是經(jīng)抗Ig的作用提高凝集反應(yīng)的靈敏度。(三)補(bǔ)體參與抗原抗體反應(yīng)這一類反應(yīng)主要包括溶血反應(yīng)(hemolytic assay)、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)(complement mediated cytotoxicuty test)及補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test)。1溶血反應(yīng)抗體與紅細(xì)胞表面抗原相遇，形成紅細(xì)胞-抗體復(fù)合物即可使加入反應(yīng)中的補(bǔ)體活化，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，此方法可用于紅細(xì)胞的各種抗原或相應(yīng) 抗體的檢測(cè)， 此法比凝集反應(yīng)敏感。 溶血反應(yīng)也是用于抗體分泌細(xì)胞即空斑形成細(xì) 胞(PFC檢測(cè)的原理。2補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試