兔輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫還原酶的功能性表達(dá)、純化及活性鑒定

1、兔輔酶依賴性視黃醇脫氫/還原酶的功能性表達(dá)、純化及活性鑒定                        【摘要】  目的：用原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)對兔輔酶依賴性視黃醇脫氫/還原酶(NRDR)進(jìn)行功能性表達(dá)，并對其活性進(jìn)行鑒定。方法：從兔肝中克隆出NRDR全長序列，運(yùn)用Gateway表達(dá)系統(tǒng)將其編碼區(qū)序列構(gòu)建到表達(dá)載體(pDEST 17)上，再轉(zhuǎn)化到大腸

2、桿菌(E.coli)(BL21_AI)中表達(dá)出兔NRDR蛋白并鑒定其表達(dá)形式；取工程菌裂解上清通過金屬離子親和層析純化出目的蛋白，再運(yùn)用反相高效液相色譜法(HPLC)測定該酶的Km值和Vmax值。結(jié)果：構(gòu)建出含兔NRDR編碼區(qū)(768bp)的表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)化到BL21_AI中表達(dá)出氨基端含6×His標(biāo)簽的重組兔NRDR蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)4h后目的蛋白可占總蛋白量的414%；經(jīng)一步親和層析得到的兔NRDR純度為972%，比活性提高了64倍；經(jīng)HPLC測定，該酶對視黃醛的Km值為(455±033)mol/L，Vmax為(0307±0065)mol/(min·mg)

3、。結(jié)論：應(yīng)用pDEST 17可在BL21_AI中對兔肝NRDR進(jìn)行高效的功能性表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】  輔酶依賴性視黃醇脫氫/還原酶 表達(dá) 純化 類視黃醇代謝    AbstractObjective: To express the rabbit NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)in prokaryotic expression system functionally, and to identify its enzyme activity.Methods: The total N

4、RDR sequence was cloned from the rabbit liver and the coding region of NRDR was constructed to the Gateway_based expression vector (pDEST 17), which was transformed into the Escherichia coli(E.coli)(BL21_AI)for the protein expression. After sonication and centrifugation of the bacteria, the soluble

5、NRDR in supernatant was purified by affinity chromatography. Furthermore, the kinetic parameters of NRDR were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results: The expression vector with the desired gene(768 bp)was constructed, and then, the NRDR protein, which was harvested at the

6、 optimal time point(4 hours after induction), was successfully expressed with a 414% expression level. Moreover, the homogeneous enzyme was obtained by a one_step affinity chromatography, with purity up to 972% and specific activity 64 fold enhanced. The values of the Km and the Vmax were(455±0

7、33)mol/L and(0307±0065)mol/(min·mg), respectively. Conclusion: The functional rabbit NRDR can be expressed effectively in BL21_AI by pDEST 17.    Key WordsNADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase；expression；purification；retinoids metabolism    維甲酸是脊椎動(dòng)

8、物體內(nèi)重要的生理活性物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞生長、形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化、免疫功能調(diào)節(jié)等生理過程1,2。維甲酸在體內(nèi)是由視黃醇(維生素A)經(jīng)兩步代謝而成，中間代謝產(chǎn)物為視黃醛，即視黃醇視黃醛視黃酸。輔酶依賴性視黃醇脫氫/還原酶NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR是從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種酶，具有很強(qiáng)的視黃醇氧化與視黃醛還原活性3。視黃醇與視黃醛之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)是體內(nèi)維甲酸合成的限速步驟，因此NRDR在調(diào)節(jié)生物體內(nèi)維甲酸的穩(wěn)態(tài)過程中起著重要作用4,5。由于直接在肝中提純該酶步驟相對較為復(fù)雜，而且提純過程中目的蛋白易于變性并

9、失去酶活性，從而對該酶的深入研究造成一定困難。本研究擬采用大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)對NRDR進(jìn)行表達(dá)、純化及功能鑒定，為其進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。    1材料與方法    11 材料    111動(dòng)物    新西蘭大白兔(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。    112主要試劑AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司，日本)；Trizol試劑、Pfx高保真DNA聚合酶和應(yīng)用Gateway技術(shù)的E.coli蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen公司，美

10、國)；膠回收試劑盒(上海華舜公司，中國)；質(zhì)粒提取試劑盒(Qiagen公司，德國)；SuperSignal West HisProbeTM試劑盒(Pierce公司，美國)；鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+ Agarose)(Amersham公司，瑞典)；還原型輔酶(NADPH)、全反式視黃醇、全反式視黃醛、咪唑(Sigma公司，美國)；HPLC級甲醇、乙腈(Fisher公司，美國)；其他為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。    12方法    121PCR引物4對引物見表1。表1PCR引物    122兔NRDR編碼區(qū)cDN

11、A克隆及全長擴(kuò)增 經(jīng)耳靜脈空氣栓塞將兔處死后取肝，勻漿處理后以Trizol試劑提取兔肝總RNA，在DU650紫外分光光度計(jì)(Beckman公司，美國)上測定OD260/280以確定純度和含量。取約1g總RNA，以O(shè)ligo dT(15)為引物，在AMV酶作用下于42反應(yīng)60min，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，冰浴終止反應(yīng)。根據(jù)兔NRDR全長序列(GeneBank登錄號(hào)：AB045133)設(shè)計(jì)引物S1和R1，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：942min；9430s，5030s，681min，35個(gè)循環(huán)；685min。    123表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)出編碼區(qū)帶attB重組位點(diǎn)的

12、修飾引物，因其較長，需采用接頭PCR(Adapter PCR)法進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪以NRDR全長擴(kuò)增序列為模板，S2、R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增:942min；9430s，551min，681min，30個(gè)循環(huán)；685min。以此PCR產(chǎn)物為模板，S3、R3為引物進(jìn)行下一輪PCR擴(kuò)增：952min；9420s，5530s，681min，9個(gè)循環(huán)；685min。以第2次PCR產(chǎn)物為模板，S3、R3為引物進(jìn)行第3輪PCR擴(kuò)增：952min；9420s，4530s，681min，8個(gè)循環(huán)；9420s，5530s，681min，22個(gè)循環(huán)；685min?；厥諗U(kuò)增片斷，按Gateway表達(dá)系統(tǒng)說明配置反應(yīng)液

13、，室溫孵育過夜進(jìn)行BP重組反應(yīng)，將NRDR編碼區(qū)構(gòu)建到供體載體pDONRTM201中，形成Gateway系統(tǒng)入門克隆，并轉(zhuǎn)化至E.coli DH5，篩選出陽性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送廣州英駿公司測序確認(rèn)，引物為P1、P2。將入門克隆與Gateway表達(dá)系統(tǒng)的pDEST 17(氨基端帶6×His標(biāo)簽)進(jìn)行LR重組反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5，接種于LB固體選擇性培養(yǎng)基(含氨芐霉素100 g/mL)倒置培養(yǎng)過夜。挑取過夜培養(yǎng)的單菌落以S2、R2為引物進(jìn)行菌落PCR篩選，并選出陽性菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至BL21_AITM，以S2、R2為引物進(jìn)行菌落PCR篩選，并選出陽性菌株，此菌

14、株即為ORDR于Gateway系統(tǒng)的原核表達(dá)菌株。    124兔NRDR在BL21_AI中的表達(dá)用含100g/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)液對表達(dá)菌株進(jìn)行培養(yǎng)(溫度37，轉(zhuǎn)速230r/min)，在細(xì)菌達(dá)到對數(shù)生長期(OD60004)時(shí)加入L_阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，每隔1h取樣，連續(xù)取樣4次。將不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)物進(jìn)行十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS_PAGE)分析確定最佳蛋白表達(dá)時(shí)間。細(xì)菌誘導(dǎo)培養(yǎng)至最佳表達(dá)時(shí)間后，以4 000g離心10min后收集菌體，以25mmol/L、pH74 PBS重懸，并洗滌2次，再次重懸后加溶菌酶至100g/mL，冰上孵育30min，于

15、400W下超聲裂菌，每超聲10s間隔10s，共1520次。裂解液于4以15000g離心10min，分別取上清液及沉淀物進(jìn)行SDS_PAGE分析和活性測定，確認(rèn)蛋白表達(dá)形式。通過HisProbeTM_HRP對表達(dá)蛋白進(jìn)行Western blot測定，進(jìn)一步確定蛋白表達(dá)及其分布比例，采用BandScan及Quantity One軟件進(jìn)行分析。    125表達(dá)蛋白活性的測定及純化在冰上配置反應(yīng)體系：25mmol/L PBS 440L，30mol/L NADPH 5L，細(xì)菌裂解液上清50L。37預(yù)熱3min，加入30mmol/L溶于二甲基亞砜的視黃醛5L，于37以200

16、r/min振蕩孵育10min，加入同體積反應(yīng)終止液(甲醇/正丁醇95/5，含100g/mL二叔丁對甲酚(BHT)終止反應(yīng)。充分混合后10000g離心1min，分離出有機(jī)相(上清液)。取有機(jī)相20L進(jìn)行高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)分析，應(yīng)用C18反相色譜柱，以乙腈(85%)和30mmol/L乙酸胺(15%)混合液為流動(dòng)相、流速15mL/min、檢測波長325nm，分析確定視黃醇的生成量。應(yīng)用Ni2+親和層析技術(shù)對重組兔NRDR進(jìn)行純化。取15mL Ni2+Agarose裝柱，將細(xì)菌裂解液上清30mL過柱，以平衡緩沖液(

17、20mmol/LpH74的磷酸納緩沖液，含05mol/L NaCl及10mmol/L咪唑)平衡約10個(gè)柱體積后分別以含250、500mmol/L咪唑的洗脫緩沖液(20mmol/LpH74的磷酸納緩沖液，含05mmol/L的NaCl)進(jìn)行洗脫(體積34個(gè)柱體積，流速1mL/min)。取流出液進(jìn)行蛋白定量、活性測定、SDS_PAGE分析。                       

18、;          126 純化蛋白活性的測定    對視黃醇溶液(1100)mol/L進(jìn)行HPLC分析，其條件見125，繪制出視黃醇濃度_峰體積定量曲線。在500L25mmol/L PBS(pH74)中加入1g純化重組蛋白和03mmol/L NADPH，分別測定視黃醛濃度為2、4、8、10mol/L時(shí)視黃醇的生成。反應(yīng)3min，其余條件見125，分離出有機(jī)相后室溫下離心真空干燥，將干燥產(chǎn)物重溶于50L反應(yīng)終止液中，取20L重溶溶液按上述方法測定視黃醇的生成，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，

19、使用雙倒數(shù)法計(jì)算該酶對于視黃醛的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。    2 結(jié)果    21入門克隆的構(gòu)建擴(kuò)增出兔NRDR全長序列后將其構(gòu)建到pDEST_17中，通過菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳分析進(jìn)行驗(yàn)證。兔NRDR編碼區(qū)全長768bp，該對引物可擴(kuò)增出27bp的attB重組位點(diǎn)序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增序列全長795bp，菌落PCR結(jié)果顯示成功擴(kuò)出目的片斷。    22 NRDR在BL21_AI中的表達(dá)入門克隆經(jīng)LR反應(yīng)獲得表達(dá)克隆，轉(zhuǎn)化至BL21_AI后經(jīng)篩選挑取陽性克隆菌株進(jìn)行菌落PCR，確認(rèn)目的片斷成功導(dǎo)入。挑取其中一個(gè)單菌落擴(kuò)

20、大培養(yǎng)分析表達(dá)效果。圖2示表達(dá)菌株在誘導(dǎo)1h后即可見目的蛋白(分子質(zhì)量：296ku)表達(dá)，隨著時(shí)間的增加表達(dá)量也逐步提高，經(jīng)BandScan軟件分析，表達(dá)后14h的目的蛋白表達(dá)量分別占總蛋白的214%、357%、376%、414%，由此確定表達(dá)最佳時(shí)間為誘導(dǎo)后4h。 L47：分別為表達(dá)菌株誘導(dǎo)14h將培養(yǎng)菌裂解后離心，分別取上清液及沉淀物進(jìn)行SDS_PAGE分析及活性測定，由SDS_PAGE(圖3，L14)及Anti_His Western blot(圖3，L57)可見大部分蛋白在沉淀中，即主要以包涵體形式存在，Quantity One軟件分析Western blot結(jié)果顯示可溶性蛋白及包涵體

21、分別占表達(dá)總蛋白量的182%和812%。    23 表達(dá)蛋白的活性測定在活性測定實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌裂解液的上清中存在明顯活性，說明有一部分蛋白通過可溶形式表達(dá)，為了避免繁瑣的包涵體復(fù)性過程，直接取上清進(jìn)行活性測定。圖4示部分視黃醛被還原成視黃醇，說明上清中含有具視黃醛還原活性的NRDR蛋白。     24 表達(dá)蛋白的純化目的蛋白經(jīng)Ni2+Agarose柱后大部分附著于凝膠上，用250、500mmol/L的咪唑溶液先后洗脫后收集洗脫液。經(jīng)過活性測定、SDS_PAGE分析，確定目的蛋白主要在含500mmol/L咪唑的洗脫緩沖液中(

22、圖5)，目的蛋白(297 ku)在SDS_PAGE上均為一條帶，經(jīng)BandScan軟件分析純度為972%。根據(jù)活性測定，純化后的兔NRDR比活性提高了64倍，蛋白回收率706%，100mL細(xì)菌培養(yǎng)液約可獲得純化蛋白100g。    25 純化蛋白活性測定使用空白對照確定視黃醛、視黃醇保留時(shí)間分別為967min和1245min，反應(yīng)體系加入純化蛋白后可以看到明顯的視黃醛消耗和視黃醇的生成，說明該純化蛋白有很高的催化視黃醛成為視黃醇活性。使用不同濃度視黃醛檢測在不同底物濃度下催化的初始速度，應(yīng)用雙倒數(shù)法得出該酶對于視黃醛的Km值為(455±033)mol/L

23、；Vmax為(0307±0065)mol/(min·mg)(圖6)。    3 討論  肝臟是視黃醇類物質(zhì)代謝的中心調(diào)節(jié)器官及作用靶器官6，NRDR的活性已在多種哺乳動(dòng)物肝中得以證實(shí)，其中以兔肝中所提純的酶活性最高3，因此本研究采用兔NRDR為目的基因進(jìn)行表達(dá)。兔NRDR的氨基酸序列TASTDGIG2027與S145_Y164_K168符合短鏈脫氫酶(SDR)的2個(gè)主要保守模序，屬于SDR家族7。SDR家族的N端序列多為親脂序列，一般起膜粘附作用8，未見其影響酶活性的相關(guān)報(bào)道。兔NRDR cDNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ229

24、_110)在5端有2個(gè)潛在的翻譯起始位點(diǎn)9，通過對純化的天然NRDR進(jìn)行N端測序發(fā)現(xiàn)，其N端從第2個(gè)AUG(起始密碼子)后第5個(gè)氨基酸開始。根據(jù)序列分析及課題組的初步實(shí)驗(yàn)，天然NRDR氨基端之前的這段序列主要在蛋白定位方面起重要作用10，對活性影響不大。因此我們構(gòu)建兔NRDR重組蛋白的編碼序列從第2個(gè)AUG后第5個(gè)氨基酸開始，而且氨基端片段帶上6×His標(biāo)簽及部分載體序列，結(jié)果表明重組的兔NRDR蛋白仍有較高活性，而且活性與文獻(xiàn)報(bào)道天然NRDR相差無幾3，證明該氨基端序列對酶活性影響不大。構(gòu)建入門克隆時(shí)，由于需要在編碼區(qū)序列兩端加上61bp的attB重組位點(diǎn)，用普通的PCR方法難以擴(kuò)

25、增出需要的序列。本研究采用接頭PCR的方法分3次反應(yīng)逐步把兩端的attB重組位點(diǎn)連接到目的片段上，而且退火時(shí)先在較低溫度下反應(yīng)幾個(gè)循環(huán)再把溫度升高，在保證反應(yīng)特異性的同時(shí)增加了反應(yīng)靈敏度。E.coli中表達(dá)的外源蛋白多以包涵體的形式存在，人NRDR在E.coli中的表達(dá)未能獲得可溶性蛋白4，本研究所表達(dá)的重組蛋白也大部分以包涵體形式存在(818%)。NRDR為活性很高的氧化還原酶，大量表達(dá)時(shí)可能對宿主細(xì)胞有很大毒性，因此我們推測它在細(xì)胞內(nèi)很難以活性形式大量存在，當(dāng)大量表達(dá)時(shí)即表現(xiàn)為不溶的包涵體形式。雖然包涵體經(jīng)過一系列變性、復(fù)性過程能得到可溶性的目的蛋白，但該過程操作繁瑣，而且蛋白損失量大，大大增加了目的蛋白的獲取難度和成本。本研究得到的重組蛋白有一部分(182%)處于溶解狀態(tài)，而且具有相當(dāng)高的還原視黃醛的活性，因此是一個(gè)有效的功能性表達(dá)系統(tǒng)，可以穩(wěn)定而又簡便地獲取NRDR蛋白。本研究構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)能夠穩(wěn)定地表達(dá)功能性NRDR蛋白，而且氨基端附帶的6×His標(biāo)簽使其能通過金屬離子親和層析一步純化獲得高純度蛋白，為進(jìn)一步研究NRDR的功能及其在脊椎動(dòng)物體內(nèi)的