凝血因子VII活性與多態(tài)性關(guān)系的研究

1、凝血因子VII活性與多態(tài)性關(guān)系的研究摘要：目的探討凝血因子VII（FVII）活性與其多態(tài)性的關(guān)系。方法運用PCR-DGGE篩查120例冠心病(CHD)和心肌梗死(MI)患者和123例健康人作對照者的FVII基因，以一期法檢測研究對象FVII活性，分析比較患者與對照者的FVII活性及其遺傳因素之間關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FVII基因3種多態(tài)性：5端-400處GA，5端-323處10 bp插入/缺失多態(tài)性，8號外顯子Arg353Gln（等位基因M1/M2）。Arg353Gln多態(tài)性與FVII活性顯著相關(guān)（P0.05），等位基因M2與低FVII活性有關(guān)。結(jié)論Arg353Gln多態(tài)性是影響FVII活性的重要標(biāo)志

2、。關(guān)鍵詞：冠心病；凝血因子VII；多態(tài)性Analysis of the relationship between FVII activity and the polymorphismTAO RongYU JindeLU Lin, et al.（Department of Cardiology, Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China）Abstract：ObjectiveTo investigate the relationship between coagulation facto

3、r VII( FVII) activity and polymorphism. MethodsDenaturing gradient gel electrophoresis technique was used to study FVII gene variation and plasma FVII activity was measured by a one-stage assay in 120 cases with CHD and 123 normal controls. ResultA novel GA polymorphism was found in the promoter reg

4、ion at position-400 bp from the start of translation. An insertion/deletion polymorphism of 10 bp in the promoter region (-323) and Arg353Gln polymorphism in exon 8 were also found. The latter was found to be associated with FVII activity. ConclusionArg353Gln polymorphism reduces FVII activity and m

5、ay be an important marker in effecting FVII activity level.Key words：Coronary heart disease;Factor VII;Polymorphism凝血因子VII(FVII)是凝血過程中的一個重要輔助因子1，是參與因子X外源性激活途徑中唯一的凝血因子。FVII是一種維生素K依賴性血漿糖蛋白，由肝臟實質(zhì)細(xì)胞分泌，活化前以單一多肽鏈形式存在。FVII被活化后，其促凝活性明顯增加。晚近，國外研究報道血漿FVII活性（FVIIc）增高是冠心病(CHD)發(fā)生的危險因素2,3，并且發(fā)現(xiàn)兩種FVII基因多態(tài)性與FVIIc存在相

6、關(guān)性4-11：位于FVII啟動子區(qū)域-323 bp處的10 bp插入/缺失多態(tài)性12；位于FVII 8號外顯子353位氨基酸ArgGln多態(tài)性4。本研究將首次在中國人群中探討血漿FVIIc、CHD和心肌梗死(MI)發(fā)生與FVII基因多態(tài)性的關(guān)系。對象與方法1. 對象：CHD 120例，平均年齡(62.510.4)歲，其中男性99例，女性21例。根據(jù)1979年WHO頒布的缺血性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷為穩(wěn)定性心絞痛46例，陳舊性心肌梗死74例，均經(jīng)冠狀動脈造影證實。正常對照組123例，平均年齡(45.810.4)歲，其中男性83例，女性40例，來自健康體檢者，經(jīng)病史、體檢、心電等檢查無冠心病表現(xiàn)。所

7、有口服或靜脈使用抗凝藥物者均排除在本研究之外。2. 血漿FVII活性測定：采5 ml靜脈血，分離血漿，按一期法測定13。3. 人基因組DNA抽提：進(jìn)行酚-氯仿抽提外周血白細(xì)胞DNA，溶于TE中。4. PCR：應(yīng)用Bio-Rad公司軟件Macmelt設(shè)計引物，在一側(cè)引物5端加一40個GC序列（GC-Clamp），使PCR產(chǎn)物端形成Tm較高不易解鏈的“夾子”。（引物序列見表1）。DNA擴(kuò)增在Pelkin-Elam 9600 PCR儀上進(jìn)行，50 l反應(yīng)體系中基因組DNA 500 ng，引物0.2 mol/L，KCL 50 mol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mol/L，

8、Taq DNA多聚酶1.5U。PCR反應(yīng)條件：94變性5 min，94變性45 s、46-54退火1 min、72延伸1 min，共35個循環(huán)，72延伸10 min。表1各DNA片段的引物設(shè)計外顯子5端引物序列3端引物序列擴(kuò)增片段長度啟動子#GTCTGGAGGCTCTCTTCAAATGAGCGGACGGTTTTGTTG168 bp區(qū)域1ACAGCATGGCCTTATGACC#ACAAAACCAGTGGCAGTCC172 bp2#GCTTCACGGAACTCGCATAAAGAGACGCAGGCGGC306 bp3，4#CTTGCTCTCTTGTTCCTTCCTCTGCAAATATGGGACC30

9、4 bp5CTGGCGTCTCGCTGACC#AGTAAGATAATCCTAGTGGGA303 bp6#TCATCCCTCACAAATCTCTTTGGAATCCTGAAGCCAG228 bp7#TCAGAGAAACAATGACAGCGACAGGGAAGAGTGGCA277 bp8-1#CTGCAGACCTAGAAATGGCAGCGCGATGTCGTGGTTG244 bp8-2#TCATCATCCCCAGCACGTACACGTTGAGGACCATGAG264 bp8-3TTCGTGCGCTTCTCATTGG#AGTCCTTGCTGCCATCCG233 bp8-4CAAATATCACGGAGTAC

10、ATGT#TTGGCTTTCTCTCCACAGG333 bp注：#GC夾子：CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCGC5. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）：根據(jù)Macmelt軟件模擬解鏈曲線的解鏈溫度，選擇7.5%聚丙烯凝膠和合適的變性梯度范圍、電泳時間。6. DNA測序：DGGE電泳中割下異常條帶，溶于三蒸水，重復(fù)PCR反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)QIAquick試劑盒純化，在ABI377測序儀上直接測序。7. 統(tǒng)計方法：組間均數(shù)比較運用t檢驗，組間頻數(shù)比較運用2檢驗。結(jié)果1. CHD組和對照組的FVII基因多態(tài)性的基因型比較：通過PCR-DGGE技術(shù)，發(fā)現(xiàn)FVII基

11、因存在3種多態(tài)性，經(jīng)測序證實（1）：5端上游-400處GA（等位基因A/G）；5端-323處10 bp（CCTATATCCT）插入/缺失多態(tài)性（等位基因0/10）；8號外顯子353位氨基酸ArgGln（GA）（等位基因M1/M2）。其中啟動子區(qū)域-400 bp處GA多態(tài)性為首次報道。對照組、CHD組和MI組間上述多態(tài)性等位基因頻率差異無顯著性。1、 9為啟動子區(qū)域-400 bp處AA等位基因，3、10、11為GG等位基因，2、4、5、6為AG等位基因。7為-323處10/10等位基因，8為0/10等位基因。1啟動子區(qū)域DGGE電泳2. FVII多態(tài)性與FVII活性的相關(guān)性分析：見表2。表2F多

12、態(tài)性與F活性的關(guān)系(s)對照組（n=123）P值CHD組（n=120）P值MI組（n=74）P值-400AGAAAGGG0.564-400AGAAAGGG0.797-400AGAAAGGG0.95498.7324.8794.6627.9192.7315.52101.0635.6798.8731.8894.7333.60106.1433.60105.5532.51102.5932.20n=32n=55n=36n=21n=70n=29n=12n=47n=15-323 0/1010/100/100/00.075-323 0/1010/100/100/00.110-323 0/1010/100/100

13、/00.14262.5078.3712.0995.8423.95-84.2922.78102.8630.03-76.1718.98106.2134.70n=1n=6n=116n=0n=7n=113n=0n=3n=71Arg353Gln*M1M1*M1M2M2M20.024Arg353Gln*M1M1*M1M2M2M20.043Arg353GlnM1M1M1M2M2M20.11796.8623.9981.4710.17-102.4628.8883.9027.19-106.4934.5778.7318.59-n=110n=13n=0n=109n=11n=0n=70n=4n=0注：與MI組比較，*

14、P0.05結(jié)果顯示：8號外顯子Arg353Gln多態(tài)性M2等位基因與低FVII活性相關(guān)，M1等位基因與高FVII活性相關(guān)。對照組和CHD組中基因型M1M1與M1M2相比，F(xiàn)VII活性差異有顯著性（P0.05）討論在1986年，NPHS研究2發(fā)現(xiàn)FVIIc每提高一個SD，5年內(nèi)心肌梗死危險性增加62%，16年隨訪后分析資料表明FVIIc水平與致命性缺血性心臟病密切相關(guān)。PRCOM研究3也得出類似結(jié)論：隨訪8年發(fā)現(xiàn)冠心病患者FVIIc水平明顯高于健康者。本研究探討了FVII與冠心病發(fā)病的關(guān)系，并對FVII基因進(jìn)行篩查，以尋找與FVIIc相關(guān)的FVII遺傳標(biāo)志。我們檢測了FVII多態(tài)性，應(yīng)用DGGE

15、技術(shù)對FVII啟動子區(qū)域及全部外顯子進(jìn)行篩查。發(fā)現(xiàn)3種多態(tài)性，其中啟動子區(qū)域-400處GA多態(tài)性為首次報道。無論是冠心病組還是對照組啟動子區(qū)域-323處10 bp插入/缺失多態(tài)性等位基因頻率較低，僅為 0.03，與Humphries等8報告的相應(yīng)基因型頻率0.20差異有顯著性。8號外顯子Arg/Gln多態(tài)性頻率也僅0.05，與ECTIM研究5所示的0.10存在差異。這可能由于不同人種和不同群體間的差異，也可能是取樣因素的影響。FVIIc與FVII多態(tài)性的關(guān)系比較明確。本研究結(jié)果提示FVIIArg353Gln多態(tài)性與FVII活性相關(guān)，M1M1基因型與高FVIIc相關(guān)，M1M2和M2M2基因型與低

16、FVIIc相關(guān)(P0.05)，與許多國外報告類似4-8，10，11。Arg353Gln多態(tài)性位于FVII分子表面，可能影響FVII與組織因子或大分子底物的結(jié)合，Gln353改變了結(jié)合部位的長度，影響FVIIa雙鏈的形成；當(dāng)出現(xiàn)ArgGln的置換可能使FVII蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，Gln353分子通過反饋調(diào)節(jié)FVII代謝，導(dǎo)致肝臟合成減少或更易從血漿中清除。FVIIArg353Gln多態(tài)性是由英國的Green等4首次報道的，他應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的方法發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性決定FVII活性，Arg/Gln等位基因者其FVII活性比平均值降低22%。以后許多研究證實了這一發(fā)現(xiàn)，并推測該多態(tài)性可能是影響FVII活性

17、的重要標(biāo)志。本研究還提示：FVII啟動區(qū)5端上游的-323處10 bp插入/缺失多態(tài)性與FVIIc的關(guān)系。10 bp缺失者其FVII活性無論在CHD組還是在對照組均明顯高于10 bp插入者，但未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.063與P=0.075），這很大程度上是由于該多態(tài)性頻率過低所造成的，可擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。一般認(rèn)為啟動區(qū)多態(tài)性是通過影響因子轉(zhuǎn)錄水平，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。綜上所述，F(xiàn)VII多態(tài)性可能是影響FVII活性的重要標(biāo)志，由于本研究中的FVII多態(tài)頻率較低，無法進(jìn)一步分組分析，我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，來探討FVII多態(tài)性與冠心病、心肌梗死之間的關(guān)系。作者單位：陶蓉（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)

18、院心內(nèi)科200025）于金德（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科200025）陸林（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科200025）樂瑋（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科200025）尤蓓（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科200025）龔蘭生（上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院心內(nèi)科200025）參考文獻(xiàn)：1Hagen FS, Gray CL, OHara P, et al. Characterization of a cDNA coding for human factor VII. Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 2412-2416.2Mead TW, M

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