光譜分析技術(shù)及相關(guān)儀器

1、第四章 光譜分析技術(shù)及相關(guān)儀器首 頁基本要求重點(diǎn)難點(diǎn)講授學(xué)時(shí)內(nèi)容提要1 基本要求 1.1掌 握掌握光譜分析的基本原理和紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和功能。掌握熒光分析的基本原理和熒光光譜儀的組成。掌握原子吸收分光光度計(jì)和原子發(fā)射光譜儀的基本原理和結(jié)構(gòu)。1.2 熟 悉熟悉常用紫外-可見分光光度計(jì)的調(diào)試、使用及維護(hù)。熟悉熒光光譜儀的調(diào)試、使用及維護(hù)。熟悉原子吸收分光光度計(jì)的性能。1.3 了 解 了解紫外-可見分光光度計(jì)的常見故障和進(jìn)展。了解熒光光譜儀的應(yīng)用方向。了解原子光譜分析儀的應(yīng)用方向。2 重點(diǎn)難點(diǎn) 2.1重 點(diǎn)紫外-可見分光光度計(jì)的基本原理、基本結(jié)構(gòu)、分類、調(diào)試及使用。熒光光譜儀的基本原理

2、、基本結(jié)構(gòu)、分類、調(diào)試及使用。原子吸收分光光度計(jì)的基本原理、基本結(jié)構(gòu)及使用。2.2 難點(diǎn) 光譜的產(chǎn)生和分類 光吸收定律 紫外-可見分光光度計(jì)的基本原理和性能評價(jià)。 熒光光譜儀的基本原理和基本結(jié)構(gòu)。 原子吸收分光光度計(jì)和原子發(fā)射光譜儀的異同。3 講授學(xué)時(shí) 建議8學(xué)時(shí)12學(xué)時(shí)4 內(nèi)容提要 4.1光譜分析技術(shù)的基礎(chǔ)理論與光譜技術(shù)的分類光譜分析技術(shù)的基礎(chǔ)理論1.光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續(xù)的微粒和連續(xù)的波動(dòng)性。波長和頻率是光的特征。 2. 光照射到物質(zhì)時(shí)，可發(fā)生折射、反射和透射。根據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)和含量的不同，可以得當(dāng)不同的吸收光譜和發(fā)射光譜。 3. 物質(zhì)的吸收光譜取決于物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，包括分子吸收

3、光譜和原子吸收光譜。分子吸收光譜包括電子、振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)這三種光譜。原子吸收光譜通常是線狀光譜，只包括外層電子躍遷吸收的能量，位于光譜的紫外區(qū)和可見光區(qū)。4物質(zhì)的發(fā)射光譜有三種：線狀光譜、帶狀光譜及連續(xù)光譜。線狀光譜由原子或離子被激發(fā)而發(fā)射；帶狀光譜由分子被激發(fā)而發(fā)射；連續(xù)光譜由炙熱的固體或液體所發(fā)射。線光譜是元素的固有特征，每種元素有其特有的不變的線光譜。光譜技術(shù)的分類利用被測定組分中的分子所產(chǎn)生的吸收光譜進(jìn)行測定的分析方法，即分子吸收法，包括可見與紫外分光光度法、紅外光譜法；利用被測定組分中的分子所產(chǎn)生的發(fā)射光譜進(jìn)行測定的分析方法，稱為分子發(fā)射法，常見的有分子熒光光度法。利用被測定組分中的原子

4、吸收光譜進(jìn)行測定的分析方法，即原子吸收法；利用被測定組分中的原子發(fā)射光譜進(jìn)行測定的分析方法，稱為原子發(fā)射法，包括發(fā)射光譜分析法、原子熒光法、X射線原子熒光法、質(zhì)子熒光法等。4.2 紫外-可見分光光度計(jì)紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)紫外-可見分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)由光源、單色器、樣品池、檢測器和放大顯示系統(tǒng)等五部分組成。光源是提供入射光的裝置，包括熱輻射燈（鎢燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。單色器是將來自光源的復(fù)合光分解為單色光并分離出所需波段光束的裝置，其性能直接影響射出光的純度，從而影響測定的靈敏度、選擇性及校正曲線的線性范圍。吸收池是用來盛放被測

5、溶液的器件，同時(shí)也決定著透光液層厚度，可用塑料、玻璃、石英或熔凝石英制成。檢測器是把光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的裝置，常用的有光電管、光電倍增管、光電二極管陣列、光電池、電荷耦合器件等。信號(hào)顯示系統(tǒng)是把放大的信號(hào)以適當(dāng)?shù)姆绞斤@示或記錄下來的裝置。常用的有直讀檢流計(jì)、電位調(diào)節(jié)指零裝置、自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。分類和各類儀器特點(diǎn)按其光學(xué)系統(tǒng)可分為單波長分光光度計(jì)（包括單光束和雙光束）和雙波長分光光度計(jì)。1.單波長單光束分光光度計(jì)是一類結(jié)構(gòu)簡單，使用、維護(hù)比較方便，應(yīng)用廣泛的分光光度計(jì)。其設(shè)計(jì)原理和結(jié)構(gòu)具有以下特點(diǎn)：單光束光路，從光源到試樣至接收器只有一個(gè)光通道，使用中依次對參考樣品和待測試樣進(jìn)行測定，然

6、后將二次測定數(shù)據(jù)進(jìn)行比較、計(jì)算，獲得最終結(jié)果；儀器只有一個(gè)色散元件，工作波長范圍較窄；通常采用直接接收放大顯示的簡單電子系統(tǒng)，用電表或數(shù)字顯示；結(jié)構(gòu)簡單、附件少、功能范圍小，不能做特殊試樣如渾濁樣品、不透明樣品等的測定。2.單光束分光光度計(jì)檢測的準(zhǔn)確性不夠穩(wěn)定，不能用于精密分析。雙光束分光光度計(jì)的光路設(shè)計(jì)在其出射狹縫和樣品吸收池之間增加了一個(gè)光束分裂器或斬波器，作用是以一定的頻率將一個(gè)光束交替分成兩路，使一路經(jīng)過參比溶液，另一路經(jīng)過樣品溶液，然后由一個(gè)檢測器交替接收或由兩個(gè)匹配器分別接收兩路信號(hào)。這是目前國內(nèi)外使用最多，性能較為完善的一類分光光度計(jì)。原理和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：從光源到檢測器有試樣光路和參

7、考光路兩條通路，可同時(shí)對檢測樣品和參考樣品進(jìn)行測定，直接獲得檢測數(shù)據(jù)，還可自動(dòng)補(bǔ)償檢測時(shí)因條件的隨機(jī)變化（如溫度變化、電源電壓波動(dòng)、放大器增益變化、儀器掃描、記錄系統(tǒng)的間隙變化等）或樣品中非測定組分的干擾所引起的影響，比單光束分光光度計(jì)使用更方便、準(zhǔn)確；一般采用兩個(gè)光柵或棱鏡加光柵的雙單色器，能有效地提高分辨率和降低雜散光；可以自動(dòng)進(jìn)行波長掃描、自動(dòng)記錄光譜曲線，也可以外接計(jì)算機(jī)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化運(yùn)行；可裝備各種附件，光、電、機(jī)緊密結(jié)合，功能范圍寬。3.雙波長分光光度計(jì)能較好的解決由于非特征吸收信號(hào)（如試樣的渾濁、吸收池與空氣界面以及吸收池與溶液界面的折射差別等）影響而帶來的誤差。其基本原理是從同一

8、光源發(fā)出的光分為兩束，分別經(jīng)兩個(gè)單色器分光后得到兩束不同波長（1，2）的單色光，經(jīng)斬光器使兩束光以一定頻率交替照射同一樣品，然后經(jīng)過檢測器顯示出兩個(gè)波長下的吸光度差值（A=A1-A2）。只要1、2選擇適當(dāng)（被測物在一個(gè)波長上有最大吸收峰，在另一個(gè)波長上沒有吸收或很少吸收；而非被測物在兩個(gè)波長上的吸收是相同的），A就是消除了非特征性吸收干擾（即扣除了背景吸收）的吸光度值。這樣即可自動(dòng)扣除背景的影響。雙波長分光光度計(jì)不用參比溶液，只用一個(gè)待測溶液，大大提高了檢測的準(zhǔn)確度。影響分光光度法準(zhǔn)確性的因素影響因素有:單色性不純、有雜散光、吸收池質(zhì)量不好或使用保管不善、電壓不穩(wěn)、檢測器負(fù)高壓波動(dòng)以及其他一些

9、因素如吸光度讀數(shù)刻度誤差、儀器安裝環(huán)境（如振動(dòng)、溫度變化）、化學(xué)因素（如熒光、溶劑效應(yīng)等）等。紫外-可見分光光度計(jì)的性能評價(jià)指標(biāo) 紫外-可見分光光度計(jì)的性能評價(jià)指標(biāo)有波長準(zhǔn)確度和波長重復(fù)性, 光度準(zhǔn)確度,光度線性范圍, 分辨率, 光譜帶寬, 雜散光, 基線穩(wěn)定度, 基線平直度等。4.3 熒光光譜儀熒光發(fā)生的機(jī)理物質(zhì)的分子吸收了照射光（如紫外線）的高能量后，處于基態(tài)最低能級的分子，被激發(fā)到第一電子激發(fā)態(tài)和其他電子激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級。到達(dá)激發(fā)態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級的分子，和周圍的分子（如溶劑分子）碰撞，并把部分能量以熱能的形式傳給周圍的分子，自己降落到單線第二電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級。然后，由此最低振

10、動(dòng)能級向基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級躍遷，同時(shí)以發(fā)光的形式釋放出其能量。簡言之，物質(zhì)經(jīng)高能量射線激發(fā)后，所發(fā)出的比原激發(fā)光波較長的可見光稱為熒光。熒光的發(fā)生和強(qiáng)度與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系。激發(fā)光譜和熒光光譜任何發(fā)射熒光的物質(zhì)都具有兩個(gè)特征光譜，即激發(fā)光譜和熒光光譜。它們是熒光分析中定性和定量的基礎(chǔ)。 1.激發(fā)光譜：將激發(fā)光的光源用單色器分光，連續(xù)改變激發(fā)光波長，固定熒光發(fā)射波長，測定不同波長的激發(fā)光照射下，物質(zhì)溶液發(fā)射的熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)光波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，即可得到熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。從激發(fā)光譜圖上可找到發(fā)生熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的激發(fā)波長ex。2.熒光光譜：選擇ex作激發(fā)光源，并固定

11、強(qiáng)度，而讓物質(zhì)發(fā)射的熒光通過單色器分光，測定不同波長的熒光強(qiáng)度。以熒光波長作橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，便得熒光光譜。熒光光譜中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的波長為 em 。 熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長（ex）和最大熒光波長（em）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)，也是定量測定中所選用的最靈敏的波長。4.3.3 熒光光譜儀的工作原理和主要結(jié)構(gòu) 對于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在激發(fā)光的頻率、強(qiáng)度以及液層厚度不變時(shí)，此熒光物質(zhì)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與溶液的濃度成正比關(guān)系。由此可以通過測定熒光強(qiáng)度來求出該物質(zhì)的含量。熒光分析法和紫外、原子吸收分析方法有本質(zhì)的不同。它所測量的是待測物質(zhì)所發(fā)射的熒光強(qiáng)弱，而不是物質(zhì)對光譜的吸收強(qiáng)弱，屬于發(fā)射光譜分

12、析。 熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)包括五個(gè)基本部分： 激光光源：用來激發(fā)樣品中熒光分子產(chǎn)生熒光。常用汞弧燈、氫弧燈及氘燈等，目前熒光分光光度計(jì)以用氘燈為多。 單色器：用來分離出所需要的單色光。儀器中具有兩個(gè)單色器，一是激發(fā)單色器，用于選擇激發(fā)光波長；二是發(fā)射單色器，用于選擇發(fā)射到檢測器上的熒光波長。 樣品池：放置測試樣品，用石英做成。檢測器：作用是接受光信號(hào)，并將其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。記錄顯示系統(tǒng)：檢測器出來的電信號(hào)經(jīng)過放大器放大后，由記錄儀記錄下來，并可數(shù)字顯示和打印。4.3.4熒光光譜儀的應(yīng)用熒光光譜儀的主要用途包括：常規(guī)分析（如定性和定量分析、化學(xué)表征、色譜流出物的檢測等

13、）；獲得分子信息（如測量分子內(nèi)間距、決定鍵合平衡、研究結(jié)構(gòu)變化等）；用于醫(yī)藥研究（如何研究膜結(jié)構(gòu)和功能、確定抗體的形態(tài)、研究生物分子的異質(zhì)性、評價(jià)藥物的相互作用、確定酶的活性和反應(yīng)、熒光免疫分析、監(jiān)測體內(nèi)化學(xué)過程等）；環(huán)境監(jiān)測（如水和空氣中污染物的鑒別和計(jì)量）等。4.4 原子光譜分析儀 原子光譜分析儀特點(diǎn)與分類原子光譜分析儀具有分析速度快、操作簡便、選擇性好、靈敏度高、測定范圍廣、試劑用量少等多種優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)測定多種元素，一般情況下不必進(jìn)行復(fù)雜的分離處理。缺點(diǎn)是不能同時(shí)測定多個(gè)元素，而且有些元素的測定靈敏度還有待提高。原子光譜分析儀器主要有原子吸收光譜儀、原子發(fā)射光譜儀和原子熒光光譜儀。原子吸

14、收光譜儀 1原子吸收光譜儀基本工作原理是測定氣態(tài)的自由原子對某種特定光譜的吸收。其結(jié)構(gòu)原理與普通的分光光度計(jì)是相似的，只是用銳線光源代替了連續(xù)光源，用原子化器代替通常的吸收池?？招年帢O燈或無極放電燈發(fā)生相應(yīng)待測元素特征波長的射線，它穿過火焰，把試樣的溶液以細(xì)粒子流的形式噴射到火焰上，部分射線被吸收。這一部分正比于試樣的濃度，測量吸收量將其與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行對比，從而確定濃度。2原子吸收光譜儀基本結(jié)構(gòu)由光源、原子化器、分光系統(tǒng)及檢測系統(tǒng)四個(gè)主要部件組成。光源的作用是發(fā)射被測元素的特征共振輻射。應(yīng)用較多的有空心陰極燈、蒸氣放電燈和無極放電燈。原子化器作用是提供能量將液態(tài)試樣中的待測元素干燥蒸發(fā)使之轉(zhuǎn)變

15、成原子態(tài)的蒸氣。常用的有火焰原子化器和無火焰原子化器兩種。分光系統(tǒng)作用是將所需要的共振吸收線分離出來。分光系統(tǒng)的關(guān)鍵部件是色散元件，可以是棱鏡或衍射光柵。檢測系統(tǒng)是將接收到的光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)，然后再經(jīng)同步檢波放大器放大，同時(shí)把接收到的非被測信號(hào)濾掉。放大了的被測信號(hào)進(jìn)入對數(shù)變換器進(jìn)行對數(shù)變換，變成線性信號(hào)，在指示儀表上顯示出來。3原子吸收光譜儀的性能包括波長精度、分辨率、對某個(gè)元素的特征濃度和檢出限等。原子發(fā)射光譜儀 1原子發(fā)射光譜法是根據(jù)處于激發(fā)態(tài)的待測元素原子回到基態(tài)時(shí)發(fā)射的特征譜線對待測元素進(jìn)行分析的方法。氣態(tài)離子或分子受熱或電激發(fā)時(shí)會(huì)發(fā)生紫外和可見光域內(nèi)的特征輻射。發(fā)射光譜就是提供足

16、夠能量的光源，使試樣蒸發(fā)并將各組分轉(zhuǎn)變成氣態(tài)原子或離子，然后引起氣體中各基本粒子的電激發(fā)，被激發(fā)的原子或離子回到基態(tài)時(shí)發(fā)射出每個(gè)元素的特征譜線，研究特征譜線的波長和強(qiáng)度就可以對被測試樣進(jìn)行定性和定量分析。由于待測元素原子的能級結(jié)構(gòu)不同，因此發(fā)射譜線的特征不同，據(jù)此可對樣品進(jìn)行定性分析；而根據(jù)待測元素原子的濃度不同，因此發(fā)射強(qiáng)度不同，可實(shí)現(xiàn)元素的定量檢測。有許多種激發(fā)方式可以激發(fā)光譜，最新技術(shù)常用的是火花式與ICP兩種方式。2.利用試樣中原子或離子所發(fā)射的特征譜線的波長或強(qiáng)度來檢測元素的存在和含量的儀器稱為原子發(fā)射光譜儀。主要有火焰光度計(jì)、火焰分光光度計(jì)、攝譜儀、光電直讀光譜儀和激光顯微發(fā)射光譜

17、儀等。它們的基本原理相同，結(jié)構(gòu)上略有差別。目前常用的是攝譜儀和光電直讀光譜儀兩類。3.攝譜儀是用光柵或棱鏡做色散元件，用照相法記錄光譜的原子發(fā)射光譜儀器，由光源、分光系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)三部分構(gòu)成，常用的激發(fā)光源有電弧光源、電火花光源、電感耦合高頻等離子體光源即ICP光源等。光學(xué)系統(tǒng)的作用是把樣品在激發(fā)源被蒸發(fā)和激發(fā)而產(chǎn)生的輻射光進(jìn)行分光，由照明系統(tǒng)、準(zhǔn)光系統(tǒng)、色散系統(tǒng)和投影系統(tǒng)組成。檢測系統(tǒng)是用感光板來檢測發(fā)射光譜。感光板由照相乳劑均勻地涂布在玻璃板上而成。通過測微光度計(jì)測量感光板上的照相乳劑感光后變黑的黑度以確定譜線的強(qiáng)度，然后與相同條件下的標(biāo)準(zhǔn)樣品譜線比較，從而測定試樣成分含量。攝譜儀最大特點(diǎn)

18、是檢測系統(tǒng)以感光板采用照相方式記錄試樣的光譜，可以把試樣的譜線拍攝長期保存?zhèn)洳椤?.用光電倍增管接收和記錄譜線的方法稱為光電直讀法。光電直讀光譜儀與攝譜儀的區(qū)別在于用光電倍增管和有關(guān)電子電路代替感光板。光電直讀光譜儀分為多道直讀光譜儀、單道掃描光譜儀和全譜直讀光譜儀三種。前兩種儀器采用光電倍增管作為檢測器，后一種采用固體檢測器。多道直讀光譜儀的優(yōu)點(diǎn)是分析速度快，準(zhǔn)確度優(yōu)于攝譜儀；光電倍增管對信號(hào)放大能力強(qiáng)，可同時(shí)分析含量差別較大的不同元素；適用于較寬的波長范圍。但由于儀器結(jié)構(gòu)限制，多道直讀光譜儀的出射狹縫間存在一定距離，使利用波長相近的譜線有困難。單道掃描光譜儀的波長選擇更為靈活方便，分析樣品

19、的范圍更廣，適用于較寬的波長范圍。但由于完成一次掃描需要一定時(shí)間，因此分析速度受到一定限制。全譜直讀光譜儀不僅克服了多道直讀光譜儀譜線少和單道掃描光譜儀速度慢的缺點(diǎn)，而且所有的元件都牢固地安置在機(jī)座上成為一個(gè)整體，沒有任何活動(dòng)的光學(xué)器件，因此具有較好的波長穩(wěn)定性。原子熒光光譜分析法是利用原子熒光譜線的波長和強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)的定性與定量分析的方法。在一定實(shí)驗(yàn)條件下，被測元素的濃度與熒光強(qiáng)度成正比，因而可據(jù)此對物質(zhì)進(jìn)行定量分析。原子熒光光譜分析法具有設(shè)備簡單、靈敏度高、光譜干擾少，工作曲線線性范圍寬，可以進(jìn)行多元素測定等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。原子熒光光譜儀分為色散型和非色散型兩類，兩類儀器的結(jié)構(gòu)基本相似，差別在于非色散儀器不用單色器。色散型光譜儀由輻射光源、單色器、原子化器、檢測器、顯示和記錄裝置組成。輻射光源用來激發(fā)原子使其產(chǎn)生原子熒光，可使用連續(xù)光源或銳線光源，常用的連續(xù)光源是氙弧燈，而可用的銳線光源有高強(qiáng)度空心陰極燈、無極放電燈及可控溫度梯度原子光譜燈和激光；單色器用來選擇所需的熒光譜線，排除其他光譜線的干擾；原子化器用來將被測元素轉(zhuǎn)化為原子蒸氣，分為火焰、電熱和電感耦合等類型；檢測器用來檢測光信號(hào)并轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，常用的檢測器是光電倍增管；顯示和記錄裝置則用來顯示和記錄測量結(jié)果