以L_半胱氨酸和吲哚酶法合成L_色氨酸

1、藥物生物技術(shù)Pharmaceutical Biotechnology2000,7(4:197199文章編號(hào):100528915(20000420197203以L2半胱氨酸和吲哚酶法合成L2色氨酸韋平和吳梧桐(中國(guó)藥科大學(xué)生物制藥學(xué)院,南京210009摘要用色氨酸酶基因工程菌WW24催化L2半胱氨酸和吲哚合成L2色氨酸。80ml反應(yīng)液(L2半胱氨酸0175g,吲哚0.75g37反應(yīng)48h,可積累L2色氨酸1.18g。L2半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為93.2%,吲哚轉(zhuǎn)化率為90.1%。產(chǎn)品總回收率達(dá)70%,所得晶體在熔點(diǎn)、旋光性和紅外吸收光譜等方面與標(biāo)準(zhǔn)品完全一致。關(guān)鍵詞L2半胱氨酸;L2色氨酸;色氨酸酶基因

2、工程菌;轉(zhuǎn)化中圖分類(lèi)號(hào):TQ46417文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A色氨酸酶正常情況下降解L2色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨,但在高濃度的丙酮酸和氨條件下也能有效地催化丙酮酸、吲哚和氨合成L2色氨酸2。該酶還能催化L2絲氨酸或L2半胱氨酸和吲哚合成L2色氨酸3。Nakazawa等(19724以20g吲哚、30g丙酮酸鈉、50g乙酸銨和4g Proteus rettgeri菌體作為色氨酸酶源,37反應(yīng)48h,可積累23g L2色氨酸。Ujimaru等(19835用A chro2 mobacter liqui dum色氨酸酶催化L2絲氨酸和吲哚合成L2色氨酸,L2絲氨酸轉(zhuǎn)化率為8214%,吲哚轉(zhuǎn)化率為9214%。鑒于

3、國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道以L2半胱氨酸和吲哚為原料酶法生產(chǎn)L2色氨酸,故本文用自行構(gòu)建的色氨酸酶基因工程菌WW246,以L2半胱氨酸和吲哚為底物合成L2色氨酸,試圖為工業(yè)化生產(chǎn)L2色氨酸建立一條合理、可行的工藝路線。1材料111菌株和培養(yǎng)基色氨酸酶基因工程菌WW24由本室構(gòu)建,E. coli BL21由南京大學(xué)生化系徐賢秀教授惠贈(zèng),LB 培養(yǎng)基(1%胰化蛋白胨,015%酵母抽提物和1%氯化鈉。112試劑磷酸吡哆醛(PL P、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG、還原型谷胱甘肽和對(duì)二甲氨基苯甲醛分別購(gòu)自Sigma公司、Promega公司、中國(guó)新興醫(yī)藥保健品開(kāi)發(fā)公司和上海試劑三廠;L2半胱氨酸、L2色氨酸購(gòu)自上海伯

4、奧生物科技公司;吲哚購(gòu)自上海雙喜香料助劑廠,其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。113儀器J22HS高速冷凍離心機(jī)(Beckman公司, DDHZ2300多用途臺(tái)式恒溫振蕩器(江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠,ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專(zhuān)機(jī)廠, 835氨基酸自動(dòng)分析儀(Hitachi,DSC225差示掃描量熱儀(Mettler公司,241MC旋光儀(PE公司,IMPACT410紅外光譜儀(Nicolet公司。2方法211工程菌WW24色氨酸酶的誘導(dǎo)表達(dá)取一個(gè)WW24單菌落接種于LB培養(yǎng)基,37培養(yǎng)過(guò)夜以獲得飽和培養(yǎng)物,將飽和培養(yǎng)物以1%接種于含791收稿日期:1999-10-10Am p (100g/m l 的L

5、B 培養(yǎng)基中,37繼續(xù)培養(yǎng)2h 后,添加IPTG 至終濃度1mm ol/L ,誘導(dǎo)表達(dá)色氨酸酶7。212色氨酸酶的活力測(cè)定按文獻(xiàn)8進(jìn)行。酶的一個(gè)活力單位定義為:在一定反應(yīng)條件下,37、10min 催化形成0101mol 吲哚所需要的酶量。213L 2色氨酸的酶法合成條件在80ml 0.1mol/L 磷酸鉀緩沖液中,分別添加0.75g L 2半胱氨酸、0.75g 吲哚、0.5mmol/L PL P 以及由150ml 培養(yǎng)液離心后收集的細(xì)菌沉淀,調(diào)p H 8.8后置37搖床輕緩振蕩使反應(yīng)進(jìn)行12,24,36和48h 。214反應(yīng)液中L 2色氨酸的檢測(cè)將振搖一定時(shí)間的反應(yīng)液經(jīng)適當(dāng)稀釋后于12000r

6、/min 離心2min ,取上清液10l 進(jìn)行紙層析檢測(cè),展開(kāi)劑系統(tǒng)正丙醇氨水水(20153。對(duì)不同轉(zhuǎn)化時(shí)間反應(yīng)液中的L 2色氨酸以氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行定量分析。3結(jié)果3.1WW 24色氨酸酶最佳活力的選擇經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)0.5,1,2,3和4h 的色氨酸酶基因工程菌WW 24,其活力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知:誘導(dǎo)1h 左右的色氨酸酶活力最高,故選擇誘導(dǎo)1h 的細(xì)胞作為L(zhǎng) 2色氨酸酶法合成的酶源 。Fig 1E ffect of induction time on the activity of WW 24tryp 2tophanase312L 2色氨酸的酶法合成由0.75g L 2半胱氨酸

7、、0.75g 吲哚、0.5mm ol/L PLP 、0.1m ol/L 磷酸鉀緩沖液及150ml 培養(yǎng)液離心后收集的細(xì)菌沉淀組成80ml 的反應(yīng)體系,調(diào)pH 8.8后于37反應(yīng)48h ,通過(guò)紙層析分析(圖2和氨基酸自動(dòng)分析儀定量,可積累1118g L 2色氨酸。L 2半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為93.2%,吲哚轉(zhuǎn)化率為90.1%。L 2色氨酸隨轉(zhuǎn)化時(shí)間的濃度變化見(jiàn)Fig 3 。1:Authentic L 2cysteine (5mg/ml ;2:Reaction catalyzed by trypto 2phanase from host strain (reaction 48h ;3、4、5:React

8、ions catalyzed by tryptophanase from engineered strain WW 24(reaction 24、36and 48h ,respectively ;6:Authentic L 2tryptophan (5mg/ml Fig 2Paper chromatogram of L 2 tryptophanFig 3Synthesis of L 2tryptophan by tryptophanase313L 2色氨酸的分離純化將收獲的轉(zhuǎn)化液于5000r/min 離心15min ,以分離殘留的吲哚和菌體。棄沉淀,上清用1%活性炭于80脫色處理20min ,

9、抽濾,濾液用HCl 調(diào)p H 至510,并于4靜置12h 。離心后所得上清用#732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離,5%氨水洗脫,洗脫液的紙層析圖譜顯示L 2色氨酸和L 2半胱氨酸混合物可逐漸分離為單一的L 2色氨酸。將紙層析顯示只含L 2色氨酸斑點(diǎn)的洗脫液合并,55減壓濃縮近乎糊狀,過(guò)濾后所得粗品于水中重結(jié)晶兩次,可得白色、片狀的L 2色氨酸晶體。產(chǎn)品L 2色氨酸的總回收率為70%。891藥物生物技術(shù)第7卷第4期314L 2色氨酸產(chǎn)品的質(zhì)量分析31411熔點(diǎn)差示掃描量熱儀測(cè)定結(jié)果為27418,與標(biāo)準(zhǔn)品27613相差115。31412旋光度PE 2241MC 測(cè)定結(jié)果為28D -31.34,符合中國(guó)藥典(

10、1990版附錄-30-33要求。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L 2色氨酸的酶法途徑中,由于底物吲哚對(duì)色氨酸酶抑制作用較弱,且丙酮酸價(jià)格不高,因而具有一定的實(shí)用性,但該途徑是色氨酸水解的逆反應(yīng),要求底物濃度較高,反應(yīng)平衡不易把握。以L 2絲氨酸和吲哚為原料合成L 2色氨酸的酶法途徑,所用的L 2絲氨酸價(jià)格幾乎與L 2色氨酸相當(dāng),因此實(shí)用性不強(qiáng)。本文用色氨酸酶基因工程菌催化L 2半胱氨酸和吲哚合成L 2色氨酸,所用底物L(fēng) 2半胱氨酸可通過(guò)毛發(fā)水解提取L 2胱氨酸后電解還原制得,產(chǎn)量高,價(jià)格低廉,且L 2半胱氨酸轉(zhuǎn)化率為93.2%,吲哚轉(zhuǎn)化率為90.1%,產(chǎn)品總回收率達(dá)70%。所以該酶法途徑具有

11、重要的工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。以L 2半胱氨酸和吲哚合成L 2色氨酸的酶法途徑主要存在兩方面的困難,一是L 2半胱氨酸在反應(yīng)過(guò)程中易氧化成L 2胱氨酸;另一是在分離純化過(guò)程中吲哚、L 2半胱氨酸和L 2色氨酸不易分離。前者可通過(guò)抗氧化劑、間歇添加L 2半胱氨酸等方法予以部分解決。至于后者,楊文革等(19969報(bào)道用#330和#732兩種樹(shù)脂串聯(lián)起來(lái)能有效地去除殘留吲哚,并且對(duì)色氨酸的總回收率大于70%。但L 2半胱氨酸和L 2色氨酸的有效分離尚有待進(jìn)一步的完善。參考文獻(xiàn)1韋平和,吳梧桐1色氨酸生物工程研究進(jìn)展J 1藥物生物技術(shù),1998,5(3:1802Watanabe T ,Snell E.Reve

12、rsibility of the tryptophanase reaction :synthesis of tryptophan from indole ,pyruvate and ammonia J .Proc N atl Acad Sci US A ,1972,69(5:10863Newton W A ,Morina Y ,Snell E.Properties of crystalline trypto 2phanase J .J Biol Chem ,1965,240(3:12114Nakazawa H ,Enei H ,Okumura S ,et al .Synthesis of L

13、2trypto 2phan from pyruvate ,ammonia and indole J .A gr Biol Chem ,1972,36(13:25235Ujimaru T ,Kakimoto T ,Chibata I.L 2Tryptophan production byAchromobacter liqui dum J .A ppl Envi ron Microbiol ,1983,46(1:16韋平和,吳梧桐,張玉彬1大腸桿菌色氨酸酶基因的克隆和表達(dá)J1中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1999,30(2:1397Sambrook J ,Fritsch E F ,Maniatis T.Mol

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15、 na Pharm aceutical U niversity ,N anji ng 210009Abstract L 2Tryptophan was enzymatically synthesized by tryptophanase in genetic engineered strain WW 24from L 2cysteine and indole. 1.18g of L 2tryptophan was formed from 0.75g of L 2cysteine and 0.75g of in 2dole in 80ml reaction mixture shaking for 48h at 37.The conversion rate was 93.2%for L 2cysteine and 90.1%for indole.The total separation recovery of the products was 70%,and the pr