親和膜色譜法純化人血漿纖溶酶原

1、親和膜色譜法純化人血漿纖溶酶原甘宏宇 商振華 秦國(guó)平 劉學(xué)良 3 王俊德(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 , 大連 116012摘 要 首次以尼龍膜為基質(zhì) , 分別采用三氯三嗪和 1,42丁二醇二縮水甘油醚活化法 , 制備了以 L 2賴氨酸為配基的親和膜 。 首次使用親和膜色譜法成功地從人血漿中快速純化出了高純度的纖溶酶原 , 電泳分析顯示一個(gè)主要的譜帶 。 為規(guī)?；焖偌兓R床用高純度纖溶酶原提供了新方法 。關(guān)鍵詞 親和膜色譜 , 人血漿 , 纖溶酶原 , 純化 2000209207收稿 ;2000212219接受本文系國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (N o. 200750311 引 言纖溶酶原

2、(plasminogen 為糖蛋白 , 分子量是 8100085000 13 , 在正常人血漿中含量約 100200mg L 4 。 纖溶酶原活化后可轉(zhuǎn)變成具有活性的血纖維蛋白溶酶 , 能溶解血液的血纖維蛋白凝塊 (fibrin clots 4 , 因此纖溶酶原是制備溶血栓藥物的主要原料 5 。 纖溶酶原的純化和測(cè)定對(duì)其臨床研究及溶栓 療法的監(jiān)控具有重要意義 6,7。Deutsch 和 Mertz1970年首先報(bào)道了利用 L 2賴氨酸為配體 , 從人血漿中純化纖溶酶原的結(jié)果 , 純化倍數(shù)為 250, 活性為 10CT A 單位吸光度 (尿激酶法測(cè)定 3 。 目前國(guó)內(nèi)外純化纖溶酶原一般采用 Se

3、pharose 24B 介質(zhì) 。 膜親和法具有快速 、 收率高的特點(diǎn) , 因此本實(shí)驗(yàn)選用價(jià)廉易得的平板尼龍膜為介質(zhì) , 分別采用 三氯三嗪 (CyCl 3 、 1,42丁二醇二縮水甘油醚 (BDE 活化法 , 偶聯(lián) L 2賴氨酸配基制備親和膜 , 首次用膜親 和法從人血漿中純化出纖溶酶原 。 2 實(shí)驗(yàn)部分2. 1 儀器與材料Automated Econo System 蛋白質(zhì)制備儀 (美國(guó) Bio 2Rad 公司 。尼龍 6平板膜 (江西慶江化工廠 , 人纖溶酶原標(biāo)樣 (69U mg 蛋白 ,Sigma 公司 , L 2賴氨酸 (Lys , 層 析純 , 上?？颠_(dá)氨基酸廠 ,62氨基己酸 (9

4、9%,ACROS , 人血漿 (大連市中心血站 , 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (磷酸化酶 B , 牛血清白蛋白 (BS A , 肌動(dòng)蛋白 , 碳酸酐酶 , 煙草花葉病毒外殼蛋白 為中科院上海生化所 東風(fēng)生化試劑廠產(chǎn)品 ; 其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 。親和純化緩沖液 :上樣緩沖液 (平衡緩沖液 :0.1m ol L pH 7. 4磷酸鹽 23mm ol L E DT A 緩沖液 ; 洗滌 液 :0.3m ol L pH 7. 4磷酸鹽 23mm ol L E DT A 緩沖液 ; 洗脫液 :0. 2m ol L 62氨基己酸溶于上樣緩沖液中 ; 再生液 :上樣緩沖液中加入 4m ol L 的脲 。 所有血

5、漿樣品均用上樣緩沖液稀釋 , 并用濾紙預(yù)過(guò)濾 , 所有鹽溶液均用二次蒸餾水配制并用 0. 45m 水膜過(guò)濾 。 2. 2 親和介質(zhì)的合成2. 2. 1 CyCl 3法 (編號(hào)為 NCH L1 將 CyCl 3活化的并鍵合了己二胺的羥乙基纖維素 (HEC 改性尼龍 膜 8,9 浸入用碳酸鹽調(diào) pH 至 910的 Lys 中 ,45 下反應(yīng)過(guò)夜 , 用茚三酮法測(cè)得配基數(shù)為 35. 34mg g 膜 。 將膜水洗后浸入 1m ol L 巰基乙醇中 (pH 7. 0 ,45 下反應(yīng) 4h 后室溫放置過(guò)夜 。 大量水洗 、 干燥 。2. 2. 2 1,42丁二醇二縮水甘油醚法 (編號(hào)為 NBH L 2

6、參考 E. K lein 及 Beeskow 等的工作制備含 HEC 的尼龍膜 1012 。 膜經(jīng) BDE 活化后浸入用 0. 5m ol L Na 2C O 3溶解的 Lys 中 , 于 75 下反應(yīng) 5h , 室溫放置 過(guò)夜 , 用大量水抽洗 。 以茚三酮法測(cè)得配基密度約為 84. 2mg g 膜 , 最后用 0. 2m ol L 乙醇胺封閉 24h 。 第 29卷2001年 8月 分析化學(xué) (FE NXI H UAX UE 研究報(bào)告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 8期 8948972. 3 人血漿纖溶酶原的親和純化步驟分別將直徑 47

7、mm 的親和膜片組裝成膜堆 , 在蛋白質(zhì)制備儀上進(jìn)行親和純化 。 用上樣緩沖液平衡 膜堆后將血漿樣品上樣 , 以洗滌緩沖液洗滌至基線平穩(wěn) , 然后用洗脫液洗脫 , 再生液再生 , 最后以平衡緩 沖液平衡膜堆 。 分別收集洗脫液和再生液 , 測(cè)定 280nm 的光密度 (A 280 , 以 BS A 為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算脫附量 。 將洗脫組分對(duì) 0. 0625m ol L pH 6. 8緩沖液透析 , 做聚丙烯酰胺變性凝膠電泳 (S DS 2PAGE 進(jìn)行分析 。 3 結(jié)果與討論3. 1 人血漿中纖溶酶原的純化結(jié)果圖 1為 NCH L1和 NBH L2親和膜堆對(duì)人血漿纖溶酶原的純化譜圖 , 數(shù)據(jù)見(jiàn)表 1。

8、 由圖 1可見(jiàn) ,NBH L2的洗脫峰面積大 , 再生洗脫峰面積小 , 二者峰面積之比是 0. 94 1, 而 NCH L1的二者峰面積之比僅為 0. 19 1。 由表 1可見(jiàn) ,NBH L2的配基密度是 NCH L1的 2倍 。 這是因?yàn)?Lys 是親水性的氨基酸 , 與含有親 水性間隔臂的 BDE 之間作用力更強(qiáng) , 因而鍵合配基數(shù)多 , 純化效果好 。由此可見(jiàn)活化方法與所鍵合的 配基類型密切相關(guān) 。圖 1 NCH L1(a 和 NBH L2(b 親和純化人血漿纖溶酶原Fig. 1 A ffinity purification of plasminogen on NCH L1(a and

9、NBH L2(b membrane stack10×<47mm 膜堆 (stack ; 樣品 (sam ple :2.5m L 人血漿用平衡緩沖液稀釋至 10m L (2. 5m L human plasmadiluted to 10ml with equilibration bu ffer ; A 280, ATT =7; 流速 (flow rate :1m L min 。表 1 NCH L1和 NBH L2親和膜堆純化纖溶酶原的結(jié)果T able 1 Purification results for plasminogen on NCH L1and NBH L2affinit

10、y membrane stack親和膜A ffinity membrane配基密度 Ligand density (mg g 62氨基己酸洗脫峰面積 Area of the main peak eluted with 62aminocaproic acid (mm 2 脲洗脫峰面積 Area of peak eluted with urea (mm 2 兩峰比例 Ratio of tw o peaks NCP L135. 31869860. 19 1NBH L284. 22802960. 94 1兩種膜的洗脫峰均有兩個(gè)峰 ,NBH L2膜洗脫時(shí)小峰與主峰之間可達(dá)到基線分離 , 而 NCH L1

11、膜洗脫 時(shí)不能達(dá)到基線分離 。 圖 2為 62氨基己酸洗脫峰和脲洗脫峰的電泳分析 , 以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn) , 確定電泳條帶的分子量 , 分子量對(duì)數(shù)與遷移距離的關(guān)系見(jiàn)圖 3。根據(jù)圖 2的電泳分析譜帶的深淺可證 實(shí)洗脫峰中峰面積大的峰為纖溶酶原 。 由于 62氨基己酸是纖溶酶原的特異性抑制劑 , 洗脫為特異性洗 脫 , 因此主峰前的小峰可能為纖溶酶原在純化過(guò)程中的降解產(chǎn)物 13 。 因 NCH L1中的疏水性間隔臂可能 與纖溶酶原的降解產(chǎn)物之間存在疏水相互作用而不能達(dá)到基線分離 。由圖 2的電泳結(jié)果可見(jiàn) ,NCH L1的 62氨基己酸洗脫峰只有一個(gè)單一的纖溶酶原譜帶 , 分子量約為 8500

12、0, 少于纖溶酶原標(biāo)樣的 4個(gè)譜帶 , 說(shuō)明純化的人血漿纖溶酶原的純度比纖溶酶原標(biāo)樣 (Sigma 高 。張永鐘等純化的纖溶酶原電泳也獲得一個(gè)譜帶 14 ,Deutsch 等獲得的是 8到 9個(gè)譜帶 3 。脲洗脫峰中有 3號(hào)和 4號(hào)二個(gè)譜帶 , 分子量分別為 60000和 55000, 與纖溶酶原標(biāo)樣中相同位置的譜帶對(duì)應(yīng) 。 上述結(jié)果表明采用 NCH L1膜親和法可以從人 血漿中得到高純度的纖溶酶原 。598第 8期 甘宏宇等 :親和膜色譜法純化人血漿纖溶酶原 圖 2 親和純化纖溶酶原洗脫峰 S DS 2PAGE 電泳分析Fig. 2 S odium dodecylsulphate polya

13、crylamide gel (S DS 2PAGE electrophoresis analysis of plasminogen purified1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白 (standard proteins ;2. 62氨基己酸從 NBH L2膜堆上洗脫下的組分 (fraction eluted by 62aminocaproic acid on NBH L2stack ; 3.62氨基己酸從 NCH L1膜堆上洗脫下的組分 (fraction eluted by 62aminocaproic acid on NCH L1stack ;4. 脲從 NCH L1膜堆上洗脫下的組分 (fraction

14、eluted with urea on NCH L1stack ; 5. 人 纖 溶 酶 原(human plasminogen 。 圖 3 S DS 2PAGE 電泳分子量的對(duì)數(shù)與遷移距離的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 3 S tandard curve of log (Mr 2trans fer distance on S DS 2 PAGE 圖 4 NBH L2膜堆親和純化人血漿中的纖溶酶原 Fig. 4 A ffinity purification of plasminogen on NBH L2stack 27×<47mm 膜堆 (stack ;20m L 人血漿用平衡緩沖液稀

15、釋至 40m L (20m L human plasma diluted to 40m L with equilibration bu ffer ; 上樣和洗脫速 度 (feed and elution rate :1m L min ; 洗 滌 速 度 (washing rate :3m L min 。 圖 2的 NBH L2的 62氨基己酸洗脫峰則有一個(gè)主要的纖溶酶原譜帶和兩個(gè)次要的 1號(hào)和 2號(hào)譜圖 5 NBH L2膜堆親和純化的纖溶酶原電泳分析 Fig. 5 S DS 2PAGE analysis of plasminogen purified onNBH L2stack 1. 62氨基

16、己酸洗脫組分 (fraction eluted with 62aminocaproic acid ; 2. 脲洗脫組分 (fraction eluted with urea ;3. 人纖溶酶原 (human plasminogen 。帶 , 分子量分別為 72000和 67000, 與纖溶酶原標(biāo)樣相比可知 ,1號(hào)和 2號(hào)譜帶是雜蛋白 。該結(jié)果與金燦煌等獲得的 4個(gè)譜帶 5 的結(jié)果相近 。 說(shuō)明 NBH L2膜的非特異性吸附高于 NCH L1膜 。3. 2 人血漿纖溶酶原的放大純化組裝 27張膜的 NBH L2膜堆 , 上樣 20m L 血漿 ,從人血漿中純化大量的纖溶酶原 。純化譜圖見(jiàn)圖4。

17、由圖可見(jiàn) ,62氨基己酸洗脫峰明顯裂分為 3個(gè) 峰 , 純化量大時(shí) , 纖溶酶原的降解產(chǎn)物峰變得明顯 。將 62氨基己酸洗脫峰 、 脲洗脫峰及標(biāo)準(zhǔn)人纖溶酶原進(jìn)行電泳 (見(jiàn)圖 5 。 電泳圖中肉眼可見(jiàn) 1個(gè)主要譜 帶和 67個(gè)次要譜帶 , 放大純化后獲得的纖溶酶原 純度提高 。 本文用 27×<47mm NBH L2親和膜堆可從 20m L 人血漿中純化出纖溶酶原 0. 5mg , 纖溶酶原回收率約為 12. 5%25%。 R eferences1 Hatton M W C , Reg oeczi E. Biochimica et Biophysica Acta , 1976,

18、427:575585698 分 析 化 學(xué) 第 29卷2 Z olton R P , Mertz E T. Can . J . Biochem . 1972, 50:5295353 Deutsch D G, Mertz E T. Science , 1970, 170:109510964 Zhong G uolong (鐘國(guó)隆 . Physiology (生理學(xué) . Beijing (北京 :People Health Press (人民衛(wèi)生出版社 , 19945 Jin Canhuang (金燦煌 ,Fan Zheng (范 征 . Chinese Journal o f Pharmaceu

19、ticals (中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志 , 1999, 30(2 :49516 Zhang Shuying (張淑英 ,Deng Wanming (鄧婉明 ,Shao Y oubo (邵幼博 . Chinese Journal o f Haenatology (中華血液學(xué)雜 志 , 1982, 3:2417 Sun D ong feng (孫東風(fēng) ,Xu G uang (徐 光 ,Cai Xu (蔡 旭 ,Wang Y uxiong (王羽雄 ,S ong H ouyan (宋后燕 ,Zhu Junren (諸駿仁 . Acta Academiae Medicinae Shanghai (上海醫(yī)科大

20、學(xué)學(xué)報(bào) , 1997, 24:52538 G an H Y, Shang Zh H , Wang J D. J . Chromatogr . A , 2000, 867:1611689 G an H Y, Shang Zh H , Wang J D , Liu X L. Chinese J . Chem . , 2000, 18(4 :51651910 K lein E , E ichholz E , Theimer F , Y eager D. J . Memb . Sci . , 1994, 95:19920411 Petsch D , Beeskow T C , Anspach F B

21、, Deckwer W D. J . Chromatogr . B , 1997, 693:799112 Beeskow T C , K ushary oto W , Anspach F B , K roner K H , Deckwer W D. J . Chromatogr . A , 1995, 715:496513 G affney P J. Haemostasis , 1988, 18:476014 Zhang Y ongzhong (張永鐘 ,Zhang H ongmin (張鴻民 . Food Science (食品科學(xué) , 1983, 21:1420Purification of Plasminogen From H uman Plasmawith A ffinity Membrane ChromatographyG an H ongyu , Shang Zhenhua , Qin G uoping , Liu Xueliang 3, Wang Junde(Dalian Institute o f Chemical Physics , Chin