丙型肝炎病毒與熒光素酶融合基因細(xì)胞模型的初步建立

1、    丙型肝炎病毒與熒光素酶融合基因細(xì)胞 模型的初步建立        摘要：目的建立容易檢測(cè)的丙型肝炎病毒(HCV)細(xì)胞模型。 方法利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建HCV cDNA與熒光素酶(luc)融合基因可調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(HHCC)，觀察luc基因的表達(dá)。 結(jié)果成功地將luc基因融合于HCV C區(qū)和大部分E1區(qū)基因的下游，構(gòu)建了帶HCV-luc融合基因的真核表達(dá)載體(pBPST-HCV-luc)；該載體在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)luc活性，

2、puromycin篩選可提高luc的表達(dá)水平，并可受四環(huán)素的調(diào)節(jié)。 結(jié)論初步建立了表達(dá)HCV C-E1和luc融合基因的可調(diào)控轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，為以HCV C-E1為靶的基因治療提供研究工具。關(guān)鍵詞：丙型肝炎病毒； 細(xì)胞模型； 熒光素酶； 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Establishment of a controllable cell model with fusion gene of hepatitis C virus cDNA and luciferase reporter geneJIA ZhanshengZHOU YongxingJIAO Chengsong, et al（Department of

3、 Infectious-Diseases, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710038,P.R.China）Abstract：ObjectiveTo establish HCV cell culture model which is easy to measure. MethodsControllable retroviral vector with fusion gene of hepatitis C virus (HCV) cDNA and luciferase (luc) reporter g

4、ene was constructed by molecular cloning technique, the transfection of this retroviral vector in a human hepatic carcinoma cell (HHCC) line was performed by lipofectAMINE and then luciferase activity in the cellular lysate was measured by scintillation counter. Results Fusion gene of the HCV 5 NCR-

5、C region and luciferase reporter gene identified by restriction endonuclease cleavage have been cloned into pBPSTR1 vector. The luciferase activity could maintain up to 20 days at least, and could be increased by puromycin treatment and regulated by tetracycline. ConclusionA cell model for expressio

6、n of HCV C-E1 and luciferase genes was established for gene therapy studies against HCV C-E1 sequences. Key words：Hepatitis C virus； Cell model； Luciferase； Retroviral vector近年來，國內(nèi)外學(xué)者從選擇HCV敏感的細(xì)胞系開始，用不同接種材料，成功地獲得了用于不同研究目的的HCV體外細(xì)胞培養(yǎng)模型1-2。然而，HCV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制和表達(dá)不穩(wěn)定，檢測(cè)方法不敏感，作為抗病毒藥物篩選模型尚不令人滿意。本研究應(yīng)用可調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBP

7、STR1，重組了HCV cDNA與luc融合基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，以期建立能在體外持久表達(dá)HCV-luc融合基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為抗病毒治療提供檢測(cè)方便敏感的細(xì)胞模型。材料與方法主要試劑：工具酶，marker,瓊脂糖等購自華美公司或Promega公司。質(zhì)粒和宿主菌：pGEM-luc-DNA質(zhì)粒為Promega產(chǎn)品，由北京醫(yī)科大學(xué)李勇年博士惠贈(zèng)3。pBPSTR1由美國Harvard醫(yī)學(xué)院Reeves教授惠贈(zèng)4，為四環(huán)素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。pBRTM/HCV1-3011(HCV-H)質(zhì)粒，由美國華盛頓大學(xué)Rice教授惠贈(zèng)5。pGEM3zf(+)等由本校生化教研室惠宏襄博士惠贈(zèng)。JM109菌本室保存。載

8、體的構(gòu)建：從pBRTM/1-3011質(zhì)粒用Hind+BamH切下1374bp的片段，內(nèi)含HCV基因序列的第3361358bp和該質(zhì)粒的357bp，反向插入pGEM-luc-DNA的Hind和BamH位點(diǎn)，HCV的C和E1融合于luc基因的上游，命名為pGEM-HCV-luc，然后再從該載體上分別用Sal+Hind雙酶切下3057bp的片段，平端克隆于pBPSTR1的Not(補(bǔ)平)位點(diǎn)，酶切鑒定方向正確者，即HCV-luc融合基因正向插入于載體的CMV啟動(dòng)子的下游，該重組質(zhì)粒命名為pBPST-HCV-luc。細(xì)胞培養(yǎng)與DNA轉(zhuǎn)染：將人肝癌細(xì)胞系(human hepatic carcinoma c

9、ell,HHCC)細(xì)胞培養(yǎng)至50%覆蓋時(shí)，用LipofectAMINE介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染經(jīng)PEG純化的質(zhì)粒DNA 10g/60mm平皿，具體方法按試劑盒說明書操作。克隆篩選：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48h，胰酶消化，1?5傳代，pBPST-HCV-luc用puromycin 2g/ml(Sigma)篩選，每3d換液1次，不同時(shí)間收集細(xì)胞，留作克隆篩選者繼續(xù)培養(yǎng)至克隆長出。細(xì)胞的收集與提取液的制備：按試劑盒說明操作。棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的滅菌PBS洗細(xì)胞2次，每培養(yǎng)瓶(25ml)加入200l預(yù)先稀釋好的細(xì)胞裂解液，置室溫15min，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，觀察細(xì)胞裂解情況。待細(xì)胞完全裂解時(shí)，用橡皮擦刮取細(xì)胞，瞬時(shí)振蕩

10、，將細(xì)胞和裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml Eppendorf管，離心，收集上清，-70保存。熒光素酶(luc)的活性檢測(cè)：取20l細(xì)胞裂解液，加入1.5ml Eppendorf管，加100l luc測(cè)試液，混勻；盡快用液體閃爍計(jì)數(shù)儀計(jì)1min的cpm值。結(jié)果1.重組載體的酶切鑒定：pGEM-HCV-luc用BamH可線性化，用Xho可切下理論為2075bp大小的片段，用Hind+Sal雙酶可切下理論為3057bp大小的片段。pBRST-HCV-luc用Hind篩選可線性化，相對(duì)分子質(zhì)量比載體大3057bp者為陽性克隆，用Hind和BamH酶切鑒定(1)。1pBPST-HCV-luc載體的酶切結(jié)果(1%

11、瓊脂糖)Fig 1. Maping of pBPST-HCV-luc vector by BanH and Hind1.DNA/EcoR+Hind marker;2.BamH;3.Hind;4.DNA/Hind marker 2.重組載體在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)：在轉(zhuǎn)染HHCC細(xì)胞后第3、5、10、15和20d收集細(xì)胞裂解液，檢測(cè)其luc活性。結(jié)果表明:pBRST-HCV-luc可在HHCC細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)luc活性，并隨轉(zhuǎn)染后的時(shí)間變化及抗性篩選而不同。經(jīng)puromycin篩選，luc活性逐漸升高，至15d以后基本穩(wěn)定(2)。2pc-HCV-luc和pBPST-HCV-luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞luc活性的比較

12、Fig 2. Luciferase activity in HHCC transfeced 3.四環(huán)素對(duì)pBPST-HCV-luc載體luc活性表達(dá)的影響：應(yīng)用pBPST-HCV-luc轉(zhuǎn)染的HHCC細(xì)胞，經(jīng)puromycin篩選后第15d，其多克隆細(xì)胞產(chǎn)生luc活性較為穩(wěn)定，接種于6孔培養(yǎng)板中，用含1.5g/ml四環(huán)素(Sigma)的PRMI 1640培養(yǎng)，第2、3和5d收集細(xì)胞，檢測(cè)luc的活性。結(jié)果表明，加四環(huán)素后第2d luc表達(dá)就明顯下降，第3d后基本穩(wěn)定，與對(duì)照組(未加四環(huán)素組)相比明顯下降(P<0.01，見3)。為觀察四環(huán)素與luc活性之間的關(guān)系，我們應(yīng)用不同濃度(0.5、

13、1.0、1.5、2.0、2.5g/ml)的四環(huán)素，在第3d收集細(xì)胞，檢測(cè)luc活性表明，兩者存在明顯的量-效關(guān)系。3四環(huán)素對(duì)pBPST-HCV-luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞luc的調(diào)節(jié)Fig 3. Regulation of luciferase activity by tetracycline 討論HCV基因表達(dá)的穩(wěn)定性和檢測(cè)方法的敏感性是建立HCV體外細(xì)胞模型的關(guān)鍵，也是抗病毒基因治療研究的基礎(chǔ)。國內(nèi)外學(xué)者近年來為此作了不少努力。劉勇等2應(yīng)用H9細(xì)胞(人CD4+T細(xì)胞)，建立了重組的HCV基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，經(jīng)RT-PCR，dot ELISA和Western blot等方法證明，該細(xì)胞模型至少可持續(xù)3個(gè)月

14、。然而，該模型的檢測(cè)不易定量。熒光素酶基因(luc)作為報(bào)告基因的一種，已廣泛用于基因調(diào)控的研究。Alt等6將luc基因融合在HCV C區(qū)66bp的下游，使其受HCV 5NCR的調(diào)控，用檢測(cè)luc活性的方法，方便地研究了抗HCV 5NCR的反義寡核苷酸的抑制作用。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可將其基因組整合于細(xì)胞染色體中，使外源基因得以持久表達(dá)。本研究選擇四環(huán)素調(diào)控性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將HCV C-E1區(qū)與luc融合基因插入該載體，經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞用抗性篩選證明，HCV-luc基因在HHCC細(xì)胞內(nèi)表達(dá)可持續(xù)20d之久，同時(shí)應(yīng)用抗HCV C蛋白單克隆抗體做Western blot證明，HCV C區(qū)基因也有效表達(dá)。然而

15、，要建立穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)生基因整合的細(xì)胞克隆還需要進(jìn)一步篩選，長時(shí)間觀察luc基因的表達(dá)活性。實(shí)現(xiàn)有效的基因治療目的，要求載體能夠在真核細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)目標(biāo)基因，并可調(diào)節(jié)目標(biāo)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。Paulus等4構(gòu)建的pBPSTR1是一受四環(huán)素調(diào)控的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，內(nèi)含有四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)活化子和四環(huán)素反應(yīng)啟動(dòng)子，可作為研究基因調(diào)節(jié)和基因治療的真核載體。本文結(jié)果，pBPST-HCV-luc的表達(dá)可受四環(huán)素調(diào)節(jié)，提示該載體還可用于其它基因功能的研究，或作為基因治療載體，以便在細(xì)胞內(nèi)有選擇性地控制目標(biāo)基因的表達(dá)。作者單位：賈戰(zhàn)生（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）周永興（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）焦成松（第四軍醫(yī)

16、大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）馮志華（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）連建奇（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）李謹(jǐn)革（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）李光玉（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科）參考文獻(xiàn)：1Kato N,Nakazawa T,Mizutani T,et al.Susceptibility of human T lymphotropic virus type I-infected cell line MT-2 to hepatitis C virus infection.Biochem Biophys Res Commun,1995,206:863-869.2劉勇，陳智，劉克洲，等.重組丙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染H9細(xì)胞模型的建立.中華肝臟雜志，1997，5:103-105.3李勇年，王勤環(huán)，斯崇文，等.丙型肝炎病毒基因調(diào)控細(xì)胞模型的建立及其意義.中華醫(yī)學(xué)雜志，1997，77:609-611.4Paulus W,Baur I,Reeves SA,et al.Self-contained,tetracycline-regulated retroviral vector system for gene delivery to mammalian cells.J Virol,1996,70:62-67.5Grakoui A,Wychowski C,Rice CM,et al.Expression