ATP熒光法微生物(細(xì)菌總數(shù))快速檢測(cè)系統(tǒng)

1、ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明書第一部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)介1、系統(tǒng)原理32、組成部件及相關(guān)功能43、應(yīng)用領(lǐng)域、特點(diǎn)、效益44、檢測(cè)注意事項(xiàng)及操作步驟.45、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)及故障排除.96、對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線.107、有關(guān)食品安全和衛(wèi)生檢測(cè)的問答.118、具體樣品檢測(cè)的操作方法及方案.14第二部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明1、技術(shù)參數(shù)及性能.232、儀器操作說明.2421開機(jī)、初始化.2422參數(shù)設(shè)置.24221選擇RLU方式.25222選擇其它樣品名方式.25223設(shè)置文件類型. .26224設(shè)置日期時(shí)間. .2

2、7 225設(shè)置檢測(cè)時(shí)間.27226 U盤格式化.2723測(cè)試.2724查詢.28241查詢測(cè)試結(jié)果.282411刪除測(cè)試結(jié)果292412刪除文件.29242查詢文件信息.30243查詢儀器信息.30244查詢電池電量.30245快速查詢.30 25通訊323、上位機(jī)軟件.3331軟件安裝3332驅(qū)動(dòng)程序的安裝3633軟件啟動(dòng)3834軟件運(yùn)行3935樣品及回歸方程設(shè)定4036 “文件名”說明4137文件、記錄操作和數(shù)據(jù)庫(kù)424、電池充電 .435、保修.43第一部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)簡(jiǎn)介1、系統(tǒng)原理螢火蟲會(huì)發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎┪灮鹣x

3、熒光素酶（簡(jiǎn)稱蟲光素酶，luciferase）、蟲熒光素（D-luciferin）以及所有細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化反應(yīng)式如下： ATPD-LuciferinO2 Mg+ AMPOxyluciferinPPiCO2Light Luciferase上式表明，只要具備適當(dāng)條件，不僅螢火蟲，即使在試管中也能發(fā)出熒光。當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中，蟲光素酶和蟲熒光素處于過量的情況下，熒光的強(qiáng)弱取決于ATP的數(shù)量。以檢測(cè)含細(xì)菌的樣品為例，細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強(qiáng)。由于蟲光素酶對(duì)AT

4、P的反應(yīng)非常靈敏，熒光強(qiáng)弱可通過熒光儀1015秒內(nèi)計(jì)量。所以，在排除樣品中非細(xì)菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細(xì)菌ATP的含量，從而確定細(xì)胞數(shù)量，因此，此系統(tǒng)為半定量快速檢測(cè)系統(tǒng)。 維持胞內(nèi)ATP濃度的相對(duì)恒定，是ATP在細(xì)胞代謝中發(fā)揮中心作用的關(guān)鍵。每個(gè)細(xì)胞的ATP量與胞內(nèi)容積成正比，但ATP量與菌落形成單位（colony-forming units=cfu）之間卻常常偏離這種關(guān)系，主要原因是樣品中細(xì)菌細(xì)胞與細(xì)胞碎片彼此聚集成團(tuán)，這種效應(yīng)曾在大腸桿菌培養(yǎng)物這種單一菌群模式系統(tǒng)中有過描述，一個(gè)菌落有可能由單個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增形成；另一種原因是檢測(cè)者沒有對(duì)樣品作適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，比如沒有

5、去除胞外游離ATP。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，不同種類細(xì)菌中的ATP含量不同，由于細(xì)菌ATP含量都處于10-18mol數(shù)量級(jí)，細(xì)微差別忽略不計(jì)，均值約為2.5×10-18mol。對(duì)于同種細(xì)菌，影響細(xì)胞內(nèi)ATP含量的因素也很多，生長(zhǎng)階段、培養(yǎng)基種類、有氧無氧以及代謝抑制物的存在，都會(huì)影響細(xì)胞數(shù)和熒光值的對(duì)應(yīng)關(guān)系。實(shí)測(cè)表明處于同一生長(zhǎng)狀態(tài)和批次樣品中的ATP是相對(duì)恒定的，即在同一環(huán)境中微生物種類及生長(zhǎng)情況固定，其ATP含量也相對(duì)恒定。2、組成部件及相關(guān)功能2.1 試劑組，按檢測(cè)操作順序分為：（1）體細(xì)胞裂解試劑（TRA），能專一而有效地裂解樣品中的非細(xì)菌細(xì)胞（主要為體細(xì)胞）并釋出ATP，然后通過

6、過濾比色杯底部的濾膜將其排除。（2）細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑（XRA），能專一而有效地裂解樣品中細(xì)菌細(xì)胞并釋出ATP。（3）熒光反應(yīng)試劑組（LLR），能與細(xì)菌ATP相互作用并有效地發(fā)出熒光。（4）物表清潔度檢測(cè)試劑組（SCR），能與物體表面ATP相互作用并有效地發(fā)出熒光。2.2 微量熒光檢測(cè)儀（也稱微量光度計(jì)），準(zhǔn)確計(jì)量檢樣的熒光值。2.3 可供100次測(cè)定的樣品預(yù)處理耗材。（1）過濾比色杯的杯架一個(gè)，用于固定過濾比色杯。（2）加壓器一個(gè)，用于加壓、排出體細(xì)胞ATP和試劑組。（3）帶濾膜熒光反應(yīng)比色杯100個(gè)，為熒光反應(yīng)容器。（4）專用無菌吸水紙，置于過濾比色杯架，吸收加壓后流出的液體。（5）帶密封圈

7、專用無菌濃縮器，用于濃縮樣品。（6）自備微生物學(xué)無菌操作所需常規(guī)用具、器皿，樣品采集無菌、無ATP的容器、塑料袋、手套、鑷子等。3、應(yīng)用領(lǐng)域、特點(diǎn)、效益使用ATP熒光法細(xì)菌快檢儀實(shí)施食品、飲料、乳品加工等全程衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)程序監(jiān)測(cè)內(nèi)容加工生產(chǎn)前生產(chǎn)設(shè)施清潔、消毒效果檢測(cè)，原、輔料細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)，以保障原料質(zhì)量或明確原料品質(zhì)級(jí)別。加工生產(chǎn)過程中生產(chǎn)設(shè)備關(guān)鍵控制點(diǎn)（例如供水、通風(fēng)閥門）衛(wèi)生學(xué)監(jiān)測(cè)，影響乳品發(fā)酵飲料、酒類特殊微生物總數(shù)檢測(cè)。加工生產(chǎn)后制成品污染細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。廢棄物排放、環(huán)境、人員衛(wèi)生學(xué)及細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)。4、檢測(cè)注意事項(xiàng)及操作步驟4.1 試劑的準(zhǔn)備和注意事項(xiàng)： 本公司提供的“ATP熒光法細(xì)

8、菌總數(shù)快檢系統(tǒng)”所含試劑組與微量熒光檢測(cè)儀需匹配使用，不可用其它試劑替代。 LLR試劑（含螢火蟲熒光素酶和D-熒光素）應(yīng)在冰箱冷凍室-20中貯存，有效期6個(gè)月。LLR試劑組易變質(zhì)，室溫下不高于25時(shí)不得超過24小時(shí)，在0-4有效期為5天。試劑（LLR）在用于檢測(cè)前按規(guī)定低溫存放，檢測(cè)前20分鐘取出平衡到室溫方可應(yīng)用。如果超過有效期，應(yīng)棄用，重新購(gòu)置。體細(xì)胞裂解試劑（TRA）及細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑（XRA）可處于室溫下保存， 2-8下保存效果最佳。，螢火蟲熒光素酶對(duì)ATP極其敏感，生物材料容易引起ATP交叉污染，所以檢測(cè)應(yīng)盡量滿足微生物學(xué)常規(guī)無菌操作，才能取得準(zhǔn)確、真實(shí)的檢測(cè)數(shù)據(jù)。4.2樣品采集和預(yù)

9、處理簡(jiǎn)介非生理?xiàng)l件下，細(xì)菌細(xì)胞的ATP濃度將急速下降，但也同樣擁有快速補(bǔ)償機(jī)制以維持胞內(nèi)ATP濃度相對(duì)穩(wěn)定，保障生命活動(dòng)正常進(jìn)行。因此，在采集細(xì)菌樣品或進(jìn)行預(yù)處理時(shí)要注意下列事項(xiàng)。4.2.1.為避免離心濃縮一類非生理狀況的步驟出現(xiàn)，可使用注射器將樣品轉(zhuǎn)移到一次性濾膜上。如需洗滌細(xì)胞，應(yīng)用無菌、無ATP的PBS緩沖液淋洗，以免影響胞內(nèi)ATP濃度。4.2.2.衛(wèi)生監(jiān)測(cè)時(shí)，常用涂抹法或用棉拭子擦拭采集樣品，但此法對(duì)于有生物膜結(jié)構(gòu)的細(xì)菌并非最佳方式，其一，細(xì)胞收集率不高；其二，棉花纖維干擾光檢測(cè)?？筛倪M(jìn)為用滴瓶將ATP提取液滴加到待檢表面，用海綿簽收集ATP后進(jìn)行光檢。 4.2.3.細(xì)胞的ATP含量與

10、細(xì)胞大小成正比，體細(xì)胞和酵母細(xì)胞的ATP含量大約分別是細(xì)菌細(xì)胞的1000倍和100倍，但ATP量和菌落形成單位（cfu）之間常常偏離這種關(guān)系，理論上每個(gè)活細(xì)胞都形成一個(gè)菌落，而實(shí)際上細(xì)胞彼此聚集常常出現(xiàn)二個(gè)或幾個(gè)活細(xì)胞形成一個(gè)菌落的情況。4.2.4.樣品預(yù)處理?？捎肁TP降解酶如三磷酸酶（apyrase）去除非細(xì)菌ATP，用溫和的去污劑如TritonX-100去除樣品中體細(xì)胞ATP，也可使用上述兩種制劑同時(shí)處理。不同試劑的處理效果因樣品而異，試劑的選擇和搭配需經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定。4.3 檢測(cè)樣品的預(yù)處理：（操作過程中需配戴一次性無菌手套）必須用無菌、無ATP的PBS溶液：磷酸二氫鉀34g；1mol/L

11、氫氧化鈉溶液175mL；蒸餾水825mL；pH7.2；使用時(shí)將上述溶液吸取1.25ml，定容至1000ml，滅菌后備用。實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌：在室溫條件下用不含鈣離子和鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌樣品細(xì)胞3次，最后用1ml同種PBS緩沖液懸浮樣品細(xì)胞。物表清潔程度：將無菌棉簽頭部用TRA試劑潤(rùn)濕，在10cm×10cm范圍內(nèi)進(jìn)行涂抹，涂抹時(shí)需不斷旋轉(zhuǎn)棉簽頭部，用1ml PBS緩沖液（不含鈣、鎂離子）浸泡棉簽頭部，從PBS緩沖液中吸出50l待測(cè)。液體樣品：純凈水、自來水等細(xì)菌含量較低的樣品需按比例濃縮；牛乳、果汁等濃度較大無法通過濾膜洗滌的樣品需按比例稀釋，稀釋液應(yīng)使用PBS（如使用國(guó)標(biāo)生

12、理鹽水，檢測(cè)數(shù)值會(huì)偏低）。液體被檢樣品含細(xì)菌細(xì)胞數(shù)若高于1000cfu/ml，可直接抽取50µl被檢樣品進(jìn)行測(cè)試；液體被檢樣品含細(xì)菌細(xì)胞數(shù)若低于1000cfu/ml，應(yīng)進(jìn)行濃縮處理。濃縮方法如下：打開專用濃縮器，用無菌鑷子取無菌過濾比色杯放入專用濃縮器內(nèi)，注意上下膠圈放好，以免濃縮樣品時(shí)發(fā)生泄露，擰緊濃縮器。用一次性無菌醫(yī)用針管抽取10ml或其整倍數(shù)的被檢樣品，接到專用濃縮器上進(jìn)行濃縮，用適當(dāng)?shù)膲毫従彽赝峦谱⑸淦鞯闹ù藭r(shí)被檢液體樣品中的細(xì)菌被過濾比色杯的微孔濾膜截留，液體部分通過濾膜被排出）直到注射器與濃縮器中的液體部分完全被推出；擰開濃縮器，用消毒過的鑷子從濃縮器中取出過濾

13、比色杯備用。固體樣品處理：無菌操作稱取25g被檢固體樣品溶于225mlPBS溶液中，然后把處理好的懸濁液用滅菌后的濾紙進(jìn)行粗濾，抽取過濾后基本澄清無肉眼可見懸濁物液體進(jìn)行測(cè)試。（注：溶于PBS后所測(cè)結(jié)果為每克樣品稀釋10倍后所得光值）。特殊樣品處理：如需檢測(cè)高鹽、高糖、深加工產(chǎn)品，含抑菌劑、色素類樣品需增加TRA洗滌次數(shù)，洗滌5次為佳。冷藏或冷凍樣品中微生物所含ATP會(huì)降低，如需檢測(cè)冷凍的肉類、面食等，需使樣品完全解凍至室溫后再進(jìn)行檢測(cè)。4.4 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線制定步驟用雙蒸水將濃度為1mM的ATP溶液，按1：10梯度比例制備成100µmol、10µmol、1µmo

14、l、100nmol、10nmol及1nmol系列溶液。用微量移液器吸取50µl熒光反應(yīng)試劑組（LLR），加入熒光反應(yīng)比色杯中，然后分別加入5µl稀釋后的各梯度ATP溶液，用微量熒光檢測(cè)儀檢測(cè)RLU值，重復(fù)上述步驟，得到系列ATP溶液數(shù)據(jù)。以RLU值為縱座標(biāo)，對(duì)應(yīng)ATP濃度系列為橫座標(biāo)作圖。在1nmol-1µmolATP濃度范圍內(nèi)，ATP濃度與相應(yīng)RLU之間存在線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)ATP溶液可以作為鑒定LLR試劑組是否失效及失效程度的陽(yáng)性對(duì)照。如按4.4.2步驟加入1nmolATP溶液時(shí)RLU值低于200，表示開始失效，應(yīng)棄用。4.5 樣品檢測(cè)步驟：4.5.1開機(jī)4.5.

15、1.1打開儀器電源前，拉開儀器抽屜，確保抽屜小槽內(nèi)清潔無異物，關(guān)閉抽屜。4.5.1.2打開電源，進(jìn)行初始化及參數(shù)設(shè)置。（詳見操作說明 ） 測(cè) 試 查 詢參數(shù)設(shè)置通 訊4.5.1.3準(zhǔn)備測(cè)試時(shí)，返回到主菜單界面（如下圖），光標(biāo)移動(dòng)到“測(cè)試”選項(xiàng)。4.5.2試劑組本底的測(cè)定4.5.2.1取出比色杯架，中間墊放5張專用吸水紙，將未放置樣品的過濾比色杯放入架孔內(nèi)。4.5.2.2拿起TRA體細(xì)胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓，排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復(fù)上述步驟一次。4.5.2.3拉開抽屜后，屏幕顯示準(zhǔn)備測(cè)試狀態(tài)（如下圖）。從杯架上取下過濾比色杯置于儀器可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)。 準(zhǔn)備測(cè)

16、試4.5.2.4拿起XRA細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，垂直滴加2滴于杯中。4.5.2.5用移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑50µl加入杯底，緩和地吸擠三次混勻。關(guān)閉抽屜，開始測(cè)試。（注意：加入LLR試劑后，反應(yīng)已經(jīng)開始，所以操作應(yīng)該迅速，務(wù)求操作時(shí)間一致，對(duì)樣品測(cè)試達(dá)到平行數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵。測(cè)量完畢前不可再拉動(dòng)抽屜。）4.5.2.6本底空白R(shí)LU讀數(shù)應(yīng)低于200，如讀數(shù)過高，則提示過濾比色杯或試劑有污染。4.5.3樣品測(cè)定4.5.3.1取出比色杯架，中間墊放5張專用吸水紙，將含濃縮后樣品的過濾比色杯放入架孔內(nèi)（不需濃縮的液體樣品用移液器直接吸取被檢樣50µl注入過濾比色杯內(nèi)進(jìn)行測(cè)試）

17、。4.5.3.2拿起TRA體細(xì)胞裂解試劑，向杯中滴加4滴，再用加壓器置杯頂加壓，排出杯中所有液體，由吸水紙吸凈。重復(fù)上述步驟一次。4.5.3.3拉開抽屜后，屏幕顯示準(zhǔn)備測(cè)試狀態(tài)（如下圖）。從杯架上取下過濾比色杯置于儀器可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)。 準(zhǔn)備測(cè)試4.5.3.4拿起XRA細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑，垂直滴加2滴于杯中。4.5.3.5用移液器從LLR試劑瓶中吸取熒光反應(yīng)試劑50µl加入杯底，緩和地吸擠三次混勻。關(guān)閉抽屜，開始測(cè)試。（注意：加入LLR試劑后，反應(yīng)已經(jīng)開始，所以操作應(yīng)該迅速，務(wù)求操作時(shí)間一致，對(duì)樣品測(cè)試達(dá)到平行數(shù)據(jù)十分關(guān)鍵）4.5.3.6根據(jù)“參數(shù)設(shè)置”所選測(cè)定模式，屏幕顯示相應(yīng)的測(cè)試

18、結(jié)果。4.6 清潔程度標(biāo)準(zhǔn)快速制訂步驟：確定質(zhì)控點(diǎn)和關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)。4.6.2清潔產(chǎn)品表面，重復(fù)二到三次以到達(dá)最佳清潔度。建議結(jié)合平皿計(jì)數(shù)和RLU值設(shè)定自己的初始化數(shù)值。連續(xù)幾天在不同位置進(jìn)行ATP衛(wèi)生監(jiān)控檢測(cè)，得出2050個(gè)結(jié)果。計(jì)算這些RLU數(shù)值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s.d）。計(jì)算通過標(biāo)準(zhǔn)RLU平均數(shù)值。將通過標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量增加2到3倍即為不合格值。警告值介于合格與污染值之間。 定期重新計(jì)算以更新限定值，不斷提高標(biāo)準(zhǔn)。5、ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)、故障排除5.1 ATP快檢系統(tǒng)使用注意事項(xiàng)：檢測(cè)完畢后，須將微量熒光檢測(cè)儀做適當(dāng)清潔以免下次使用時(shí)交叉污染。儀表外部可用干凈的微濕布巾擦拭，可拉動(dòng)抽屜可用

19、沾有少許異丙醇或酒精的棉簽擦拭。為保持檢測(cè)工作臺(tái)不受污染，可用75%醫(yī)用酒精擦拭桌面，或在超凈臺(tái)內(nèi)操作。操作時(shí)要戴一次性無菌手套，或用75%醫(yī)用酒精擦拭雙手以免試劑、臺(tái)面污染。臨用前套上無菌移液管尖，使用移液器吸取或轉(zhuǎn)移試劑、樣品時(shí)務(wù)求準(zhǔn)確，避免移液器與樣品或試劑交叉污染。完成檢測(cè)后，立即取下過濾比色杯。未取出前，避免晃動(dòng)或倒置微量熒光檢測(cè)儀以免杯內(nèi)試劑濺出污染光學(xué)部件。冷藏或冷凍樣品將導(dǎo)致其中微生物（細(xì)菌）細(xì)胞ATP量變化明顯，應(yīng)于避免，或待完全解凍平衡至室溫后再做檢測(cè)并設(shè)置對(duì)照。高鹽、高離子、高糖或高油脂組份將干擾ATP檢測(cè)，重復(fù)加入體細(xì)胞裂解試劑（TRA）可改善。5.2 故障排除：故障可

20、能原因排除方法在無過濾比色杯或樣品情況下，可拉動(dòng)抽屜推入后，仍顯示高背景讀數(shù)1、抽屜被樣品污染2、光敏部件有誤1、用酒精擦抽屜去除污染2、更換或檢修測(cè)光儀有樣品的可拉動(dòng)抽屜推入后無讀數(shù)1、電池電量不足2、斷電3、可拉動(dòng)抽屜關(guān)閉不嚴(yán)1、如顯示電池電量不足，需充電2、查對(duì)供電情況3、重新關(guān)閉抽屜給出的讀數(shù)顯著低于應(yīng)有讀數(shù)1、試劑過期，失效 2、加入LLR試劑后沒有立即關(guān)閉抽屜讀數(shù)3、樣品經(jīng)冷凍或冷藏后使其中的細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)ATP量顯著降低1、及時(shí)更換試劑2、更換樣品，重新試驗(yàn)讀數(shù)3、待樣品及試劑恢復(fù)到室溫后再測(cè)定6、對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線6.1 ATP濃度和相應(yīng)熒光值（RLU）關(guān)系曲線 與分別表示采用本公司提供

21、的微量熒光檢測(cè)儀及美國(guó)New Horizons公司PROFILE-1-3560微量熒光檢測(cè)儀所得結(jié)果。分別以log相對(duì)熒光值（RLU）、logATP濃度（atto mol）值為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)作圖（y = 0.8362x + 1.175，R2= 0.9866）。上圖表明，在ATP濃度為1pmol1nmol范圍內(nèi)，ATP濃度與RLU呈線性關(guān)系。6.2 不同濃度多種細(xì)菌混合物熒光值和相應(yīng)細(xì)胞數(shù)關(guān)系曲線圖、分別表示三批次不同濃度大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)物的混合物，進(jìn)行平皿計(jì)數(shù)和相對(duì)熒光值檢測(cè)（本公司微量熒光檢測(cè)儀），并分別以log相對(duì)熒光值（RLU）和log平皿計(jì)數(shù)值（cfu/ml）為縱

22、坐標(biāo)和橫坐標(biāo)作圖。由上述關(guān)系圖推演的RLU-CFU（相對(duì)熒光值對(duì)應(yīng)細(xì)菌菌落總數(shù)）可供參考。7、有關(guān)食品安全和衛(wèi)生檢測(cè)的問答一問：哪些因素可能影響食品安全和衛(wèi)生？生物（如細(xì)菌總數(shù)超標(biāo)、致病菌污染等）、化學(xué)（農(nóng)藥殘留、有毒添加劑等）、物理（放射污染等）及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品（有害遺傳效應(yīng)等）四大因素。其中，以細(xì)菌污染食物、飲用水引發(fā)食源性中毒最為常見，其危害的范圍最廣。二問：國(guó)內(nèi)外通常采用什么方法進(jìn)行食品細(xì)菌總數(shù)和衛(wèi)生、防疫檢測(cè)？“常規(guī)法”和“ATP熒光快檢法”。常規(guī)法是我國(guó)衛(wèi)生部規(guī)定至今仍然沿用的方法，因此，又稱“國(guó)標(biāo)法”，即（細(xì)菌）活細(xì)胞平皿計(jì)數(shù)法。三問：“常規(guī)法”和“ATP熒光快檢法”的共同點(diǎn)和主要差

23、別是什么？?jī)煞N方法都能用于檢測(cè)樣品中的細(xì)菌總數(shù)，提供有關(guān)衛(wèi)生防疫數(shù)據(jù)。主要差別在“時(shí)效性”，常規(guī)法至少要12天才能得到結(jié)果，快檢法能在15分鐘內(nèi)得到實(shí)時(shí)檢測(cè)數(shù)據(jù)。四問：為什么兩種方法在“時(shí)效性”上有這樣大的差異呢？因?yàn)樗鼈兯罁?jù)的基本原理各不相同?！俺Ｒ?guī)法”是讓檢樣中原先看不見的細(xì)菌細(xì)胞，在稀釋涂布后通過在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上37，48小時(shí)的保溫培育，這樣，一個(gè)活的細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)多次分裂繁殖形成數(shù)以億計(jì)，肉眼可見的細(xì)菌集群（菌落），然后通過計(jì)數(shù)得到結(jié)果，即菌落形成單位/毫升（克）CFU/ml（g）。“ATP熒光快檢法”則基于蟲光素酶能催化細(xì)菌細(xì)胞的ATP發(fā)出熒光，熒光檢測(cè)儀能快速、準(zhǔn)確計(jì)量熒光值的原理

24、。因此，檢樣中細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量就越大，發(fā)出的熒光就越強(qiáng)。這樣，在排除檢樣中非細(xì)菌ATP干擾的情況下，檢測(cè)熒光值（RLU）就能確定細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)CFU/ml（g）。五問：兩種檢測(cè)方法哪一種更準(zhǔn)確？?jī)煞N檢測(cè)方法得到的數(shù)據(jù)一致嗎？在回答這一問題前，讓我們重溫微生物學(xué)的兩個(gè)基本概念：細(xì)菌或微生物對(duì)人類生活，生產(chǎn)造成的有利（如用于抗菌素生產(chǎn)）或有害影響（如污染食品、引發(fā)疾?。┒挤菃我换蛏贁?shù)細(xì)菌細(xì)胞的作用，而是單位體積內(nèi)數(shù)以十萬(wàn)、百萬(wàn)細(xì)胞群體的效應(yīng)。其次在適宜條件下，細(xì)菌每2030分鐘就能分裂繁殖一代。以大腸桿菌為例，10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升二小時(shí)后就成了640萬(wàn)細(xì)胞/毫升。因此，正確的回答是，兩種方法都能

25、滿足特定時(shí)期細(xì)菌總數(shù)檢測(cè)和衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的需求，但時(shí)效性有重大差異?？鞕z方法更有利于保障食品安全水平的全面提高。通過常規(guī)法和ATP熒光快檢法實(shí)際檢測(cè)建立一個(gè)兩者之間可以互相參照，符合食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的有效范圍（如合格、警告、不合格）是發(fā)達(dá)國(guó)家的通用做法。六問：在食品安全方面國(guó)外有哪些值得借鑒的經(jīng)驗(yàn)和措施？上世紀(jì)90年代后，美、英、日等國(guó)就已依據(jù)螢火蟲發(fā)光原理，研制并推廣使用ATP熒光法快檢設(shè)備用于檢測(cè)食品細(xì)菌總數(shù)或衛(wèi)生防疫監(jiān)測(cè)。這些設(shè)備既能提供實(shí)時(shí)的檢測(cè)數(shù)據(jù)，又有準(zhǔn)確、便攜、使用容易等特點(diǎn)。不僅彌補(bǔ)了“常規(guī)法”時(shí)效性差的不足，又能發(fā)揮防患于未然的預(yù)警作用。有效地保障了食品安全總體水平的提高，也促進(jìn)了

26、如HACCP等食品衛(wèi)生理念的誕生。七問：HACCP認(rèn)證體系的主要涵義和作用是什么？HACCP是“危害分析關(guān)鍵控制點(diǎn)”一詞的英語(yǔ)縮寫，源于上世紀(jì)70年代美國(guó)太空總署提出的有關(guān)食品安全基本理念，即（1）危害食品安全的可能因素包括生物（轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品）、化學(xué)、物理四個(gè)方面；（2）從原料到食品通常經(jīng)歷加工生產(chǎn)產(chǎn)品包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸配發(fā)銷售等環(huán)節(jié)；（3）食品原料的品質(zhì)、生產(chǎn)環(huán)境、設(shè)施、操作人員的衛(wèi)生水平都將影響終產(chǎn)品食品的安全衛(wèi)生水平。因此，只有將所有可能影響食品安全的危害因子全部納入監(jiān)控范圍，采用快檢方法實(shí)施監(jiān)控才能從源頭開始，從而有效地保障食品，并留有補(bǔ)救時(shí)間防患于未然。美、日、歐盟等國(guó)已將實(shí)施HACCP

27、認(rèn)證體系列為法定措施。我國(guó)衛(wèi)生部已于2002年頒發(fā)食品加工企業(yè)的HACCP實(shí)施指南衛(wèi)法監(jiān)發(fā)174號(hào)。八問：“ATP熒光快檢法”和實(shí)施食品安全的HACCP預(yù)警、溯源管理制度有何關(guān)系？在建立和推廣使用ATP熒光法快檢技術(shù)前，只能靠目測(cè)或平皿計(jì)數(shù)法評(píng)估產(chǎn)前或清潔消毒后生產(chǎn)線、食品接觸表面的衛(wèi)生水平。這兩種方法要不是靈敏度不夠，就是取得結(jié)果的時(shí)間太長(zhǎng)，無法滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。換一句話說，只有采用ATP熒光法快檢一類方法才能實(shí)施HACCP和食品安全的溯源和預(yù)警制度。九問：美、日、歐盟各國(guó)如何評(píng)價(jià)ATP熒光快檢法和建立相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)？通過ATP熒光快檢法得到的是來自食物殘?jiān)臀⑸锛?xì)胞兩個(gè)部分ATP的總值。

28、多數(shù)情況下，來自微生物細(xì)胞的比例較小。但是，由于食物殘?jiān)仁俏⑸锷L(zhǎng)的培養(yǎng)基，又起抵消滅菌效果的作用。因此，關(guān)鍵在確定避免重新污染的ATP臨界值，而非單純依據(jù)細(xì)菌細(xì)胞ATP值折算的細(xì)菌菌落數(shù)（cfu）。這就是多數(shù)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)試劑盒不設(shè)置通用ATP標(biāo)準(zhǔn)，也不必期望ATP與CFU之間有確定相關(guān)關(guān)系，容易引起初用者疑慮的原因。統(tǒng)計(jì)結(jié)果證實(shí)，凡ATP熒光法顯示衛(wèi)生水平改善，則平皿計(jì)數(shù)結(jié)果也一定改善。如果檢測(cè)點(diǎn)ATP水平高，即便是無菌的，次日早上必然大量滋生細(xì)菌導(dǎo)致食品污染。因此，發(fā)達(dá)國(guó)家的普遍做法是：首先通過ATP快檢步驟對(duì)食品原料及經(jīng)過清潔、消毒后食品原料接觸表面是否達(dá)到衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)作出有數(shù)字依據(jù)的評(píng)價(jià)。

29、其次，對(duì)易于引發(fā)微生物污染的關(guān)系部位實(shí)施重點(diǎn)監(jiān)控。最后，制訂出符合本單位情況，又符合衛(wèi)生要求的ATP數(shù)值范圍。十問：具備什么條件有利于在我國(guó)普遍實(shí)施HACCP認(rèn)證體系？（1）發(fā)展擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的食品安全關(guān)鍵技術(shù)，提供準(zhǔn)確、有效、便攜、操作容易、價(jià)格能為國(guó)內(nèi)廣大用戶接受的食品安全檢測(cè)設(shè)備和試劑系統(tǒng)。（2）建立與快檢技術(shù)相匹配的國(guó)家、企業(yè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。（3）普及與快檢技術(shù)相關(guān)的衛(wèi)生學(xué)和衛(wèi)生監(jiān)督指導(dǎo)新理念、新知識(shí)。8.具體樣品檢測(cè)的操作方法及方案飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP生物熒光快速檢測(cè)法和分級(jí)判定（草案）1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP（三磷酸腺苷）生物熒光快速檢測(cè)法的術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)方法、細(xì)

30、菌指標(biāo)的分級(jí)及判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用飲用水細(xì)菌指標(biāo)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。2 術(shù)語(yǔ)和定義2.1相對(duì)發(fā)光值 RLU （relative light unit）樣品與試劑反應(yīng)經(jīng)微量熒光檢測(cè)儀檢測(cè)后，所顯示在儀器上的讀數(shù)。3 原理在有氧的條件下，蟲光素酶催化D-熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光，其生化反應(yīng)式如下： ATPD-LuciferinO2 Mg2+ AMPOxyluciferinPPiCO2Light Luciferase當(dāng)反應(yīng)系統(tǒng)中，蟲光素酶和D-熒光素處于過量的情況下，熒光的強(qiáng)弱取決于ATP的數(shù)量。以檢測(cè)含細(xì)菌的樣品為例，細(xì)菌細(xì)胞越多，ATP量越高，發(fā)出的熒光也就越強(qiáng)。在排除樣

31、品中非細(xì)菌ATP干擾的情況下，通過熒光值就能確定樣品中細(xì)菌ATP的含量，通過測(cè)量相對(duì)熒光值從而快速得知被檢飲用水的細(xì)菌指標(biāo)。4試驗(yàn)設(shè)備和材料4.1微量熒光檢測(cè)儀：量程范圍0-1010cfu/mL實(shí)際檢測(cè)靈敏度（ATP）5×10-18mol檢測(cè)時(shí)間1秒-99秒自由設(shè)定精確誤差±5%由儀器生產(chǎn)廠家采用穩(wěn)定的C14放射源進(jìn)行定標(biāo)、校準(zhǔn)可檢波長(zhǎng)300nm650nm4.2試劑組，按檢測(cè)操作順序分為：體細(xì)胞裂解試劑：主要成份是非離子去污劑及表面活性劑，能專一而有效地裂解樣品中的非細(xì)菌細(xì)胞（體細(xì)胞）并釋出ATP，然后使用過濾比色杯底部的濾膜將體細(xì)胞裂解試劑、體細(xì)胞碎片及游離ATP排除，試

32、劑可室溫保存。細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑：主要成份是陽(yáng)離子去污劑及表面活性劑，能專一而有效地裂解樣品中細(xì)菌細(xì)胞并釋出ATP，試劑可室溫保存。熒光反應(yīng)試劑組：主要成份是D-熒光素、蟲熒光素酶、鎂離子，能與樣品中的細(xì)菌ATP相互作用并發(fā)出熒光,20低溫避光貯藏。4.3樣品預(yù)處理耗材。過濾比色杯的杯架一個(gè)，用于固定過濾比色杯。加壓器一個(gè)，用于加壓、排出體細(xì)胞ATP和體細(xì)胞裂解試劑。帶0.45m濾膜熒光反應(yīng)過濾比色杯，為熒光反應(yīng)容器。專用無菌吸水紙，置于過濾比色杯架，吸取加壓后流出的液體。帶密封圈無菌濃縮器，用于濃縮樣品。自備微生物學(xué)無菌操作所需常規(guī)用具、器皿、樣品采集無菌、無ATP的容器、塑料袋、手套、鑷子等

33、。5 分析步驟5.1打開微量熒光檢測(cè)儀電源，使微量熒光檢測(cè)儀進(jìn)入系統(tǒng)初始化。5.2飲用水的濃縮處理：用注射器從樣品中取出10ml的待測(cè)飲用水。打開微量熒光檢測(cè)儀檢查過濾比色杯讀數(shù)為0后，將過濾比色杯放入無菌濃縮器內(nèi)，并使注射器接到濃縮器上，用適當(dāng)?shù)膲毫従復(fù)葡伦⑸淦髦?，直到注射器中的溶液推凈。用消毒過的鑷子從濃縮器中取出過濾比色杯，放在墊有吸水紙的過濾比色杯架上。5.3樣品檢測(cè)步驟：取出過濾比色杯架，底層墊放5張專用無菌吸水紙，并將帶濾膜比色杯放入架眼內(nèi)，用移液器吸取檢樣50µL注入杯底。檢測(cè)前打開熒光檢測(cè)儀電源，此時(shí)液晶顯示屏顯“0”值。將體細(xì)胞裂解試劑向杯中滴加4滴，加壓器置杯

34、頂加壓，使杯中非細(xì)菌ATP、游離ATP通過底部濾膜排出，由吸水紙吸凈。重復(fù)加壓步驟一次。將細(xì)菌細(xì)胞裂解試劑向杯中滴加2滴，取下比色杯置于可拉動(dòng)抽屜內(nèi)。用移液器從熒光反應(yīng)試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑50µL加入杯底，緩和地吸擠三次，混勻反應(yīng)液。（關(guān)閉抽屜）設(shè)置檢測(cè)時(shí)間為10s，屏幕顯示的相對(duì)熒光值（RLU）對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行合格及不合格判定。6細(xì)菌指標(biāo)分級(jí)及判定分級(jí)及判定見表1。RLU潔凈度分級(jí)判 定400清 潔合 格4011000警 告不 合 格1000污 染ATP生物熒光快速檢測(cè)衛(wèi)生學(xué)方面監(jiān)測(cè)（草案） 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方面檢測(cè)可以使用中西公司生產(chǎn)的ATP熒光法餐飲具及清潔度快檢試劑。范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、

35、原理、試驗(yàn)設(shè)備和材料參照“飲用水細(xì)菌指標(biāo)ATP生物熒光快速檢測(cè)法和分級(jí)判定”。簡(jiǎn)易操作如下：（1）帶上一次性無菌手套，打開餐飲具清潔度快檢試劑包裝袋（鋁膜復(fù)合包裝），取出1根無菌棉簽，并掰下一個(gè)透明檢測(cè)杯，注意不要污染杯內(nèi)白色檢測(cè)膜。（2）取無菌棉簽，在棉簽頭部滴加5滴細(xì)菌細(xì)胞釋放劑(XRA)，使棉簽頭部濕潤(rùn)，然后用此棉簽在被測(cè)處橫豎往返均勻涂擦,并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽，采樣總面積100cm2。（3）將透明檢測(cè)杯放入可拉動(dòng)抽屜小孔內(nèi)，再向棉簽頭部滴加1滴細(xì)菌細(xì)胞釋放劑(XRA)后置于透明檢測(cè)杯中的白色檢測(cè)膜上，使液體全部被吸收。（4）立即關(guān)閉抽屜，進(jìn)行測(cè)試操作。操作應(yīng)該迅速，務(wù)求試驗(yàn)操作時(shí)間一致以得到

36、平行測(cè)試數(shù)據(jù)。測(cè)量完畢前不可再拉動(dòng)抽屜。（5）屏幕顯示相應(yīng)的測(cè)試結(jié)果。RLU潔凈度分級(jí)判 定300清 潔合 格301-900警 告不 合 格900污 染ATP熒光法應(yīng)用于化妝品微生物的比對(duì)試驗(yàn)方案根據(jù)國(guó)外知名ATP快檢企業(yè)Celsis在其網(wǎng)站上提過的相關(guān)資料可以知道，當(dāng)檢測(cè)化妝品時(shí)使用Rapiscreen系統(tǒng)一般需要24-48小時(shí)，這個(gè)過程主要是一個(gè)微生物的富集和增殖的過程。通過24小時(shí)增殖的過程可以檢測(cè)到1 cfu/g的微生物，所以微生物的污染程度很低的時(shí)候理論上低于1000cfu/g就有必要進(jìn)行這種富集和增殖的過程。對(duì)于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只需要簡(jiǎn)單的三個(gè)步驟：把樣品用

37、培養(yǎng)基稀釋成(1% - 10% w/v)，可根據(jù)國(guó)標(biāo)1：10進(jìn)行稀釋。在32培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，具體時(shí)間根據(jù)樣品判定標(biāo)準(zhǔn)和試劑靈敏度確定。經(jīng)過培養(yǎng)后取均勻的50微升用ATP熒光法進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行樣品微生物富集和增殖的培養(yǎng)基也是關(guān)鍵，培養(yǎng)基要能保證適合各種微生物生長(zhǎng)并且能夠中和樣品中的防腐劑和去污劑成分，同時(shí)培養(yǎng)基本身的ATP背景要保證非常低。Letheen牌的改良肉湯培養(yǎng)基是個(gè)不錯(cuò)的選擇，如果沒有可用國(guó)標(biāo)法的培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。先用LLR試劑檢測(cè)國(guó)標(biāo)法的培養(yǎng)基如果ATP背景較高，則需要用apyrase處理使本底降低。目前國(guó)標(biāo)法中和劑為卵磷脂和吐溫80。1 實(shí)驗(yàn)儀器試劑1.1 樣品：市面上

38、銷售的化妝品，每個(gè)樣品都需有無菌對(duì)照樣品1.2 儀器和試劑1.2.1 儀器 ATP生物發(fā)光快速檢測(cè)系統(tǒng)配套儀器，包括：BLW0401微量光度計(jì)、過濾比色杯、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、1ml移液槍及槍頭。1.2.2 試劑發(fā)光反應(yīng)試劑（LLR）、細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑（XRA）、卵磷脂吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、液體石蠟和吐溫80、PBS緩沖液。卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化鈉 5g瓊 脂 15g卵磷脂 1g吐溫80 7g蒸餾水 1000mL現(xiàn)在有商售的，可直接加水配制。卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基成分：蛋白胨 20g牛肉膏 3g氯化鈉 5g卵磷脂 1g吐

39、溫80 7g蒸餾水 1000mL制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80，將其他成分加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻，調(diào)pH 值為7.17.4，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。0.5氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyl terazolium chloride，TTC）成分：TTC 0.5g蒸餾水 100mL溶解后過濾，103.43kPa（121 15 lb）20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4冰箱備用。2 實(shí)驗(yàn)方法 取化妝品10g置于滅菌的錐形瓶中，用培養(yǎng)基稀釋成(1% - 10% w/

40、v)，可根據(jù)國(guó)標(biāo)1：10進(jìn)行稀釋， 對(duì)于油包水型化妝品還應(yīng)加液體石蠟和吐溫80 助溶劑，充分震搖樣品使其充分混合均勻，在32培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)。2.1 平板菌落計(jì)數(shù)法按照化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）中菌落總數(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。2.2 ATP熒光法2.2.1用移液槍抽取50l樣品加入到過濾比色杯；2.2.2再滴加2滴XRA；2.2.3用移液槍加50l LLR，推入儀器抽屜讀數(shù)。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 平板菌落計(jì)數(shù)法根據(jù)化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007年版）中微生物檢驗(yàn)法總則中的相關(guān)菌落計(jì)數(shù)方法進(jìn)行平板菌落的計(jì)數(shù)。3.2 ATP熒光法的標(biāo)準(zhǔn)確定將ATP熒光法測(cè)的熒光值與相應(yīng)的菌落計(jì)數(shù)法所得的數(shù)值進(jìn)

41、行比較，初步確定出ATP熒光法檢測(cè)化妝品菌落總數(shù)的判定標(biāo)準(zhǔn)。然后再通過3-4個(gè)批次的ATP熒光法檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法得到的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比對(duì)來修正判定標(biāo)準(zhǔn)。ATP熒光法應(yīng)用于乳品微生物的應(yīng)用指南一、背景資料ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法是乳品中細(xì)菌總數(shù)快檢中較為成型的方法，已經(jīng)在歐美普遍推廣，我國(guó)的臺(tái)灣地區(qū)于1999前后引進(jìn)并推廣該技術(shù)。目前國(guó)際上比較有名的Celsis M4000 system是這個(gè)方面的先驅(qū)，但價(jià)格極為昂貴售價(jià)約為人民幣50萬(wàn)左右，難于得到廣泛應(yīng)用和推廣。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)周劍忠、董明盛發(fā)表的生物熒光技木在乳品工業(yè)中的應(yīng)用及東北農(nóng)業(yè)大學(xué)田波、霍貴成等發(fā)表的乳與乳制品中細(xì)菌總數(shù)的檢測(cè)技術(shù)

42、，分別屬于國(guó)家科技攻關(guān)項(xiàng)目(2002BA518A12) 和“十五”重大攻關(guān)項(xiàng)目（2002 BA518A06）均把ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)方法作為一個(gè)乳品中細(xì)菌總數(shù)快檢的一個(gè)成型技術(shù)和發(fā)展方向加以介紹和推廣。中西公司自主開發(fā)生產(chǎn)的ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快速檢測(cè)已經(jīng)達(dá)到了國(guó)外先進(jìn)水平，并在東北農(nóng)大教育部乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心進(jìn)行了相關(guān)原料奶的相關(guān)技術(shù)性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果是工作性能比較穩(wěn)定，對(duì)周圍環(huán)境要求低（電流、電壓、噪聲、溫度等），體積小，易操作，工作流程簡(jiǎn)捷、清晰，操作結(jié)果可儲(chǔ)存并以文件記錄的方式查詢，可與電腦連接實(shí)時(shí)檢測(cè)并傳輸檢測(cè)結(jié)果，可直接將檢測(cè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成EXCEL

43、文件，便于統(tǒng)計(jì)、匯總。經(jīng)過對(duì)比在原料乳的檢測(cè)中可有效排除原奶中的游離體細(xì)胞干擾，ATP檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果基本相符合。二、乳品檢測(cè)中應(yīng)用的方向1. 在未經(jīng)處理的原料乳質(zhì)量控制中的應(yīng)用用ATP生物熒光法對(duì)原奶中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，可以便于乳品企業(yè)在收奶的過程中對(duì)原奶的品質(zhì)做出快速判斷，不合格的原奶當(dāng)場(chǎng)拒收，合格的可根據(jù)檢測(cè)結(jié)果對(duì)其進(jìn)行分級(jí)。2.在巴氏殺菌奶質(zhì)量控制中的應(yīng)用制定貨架期，控制巴氏殺菌后牛奶的二次污染對(duì)公眾的健康有著重要意義。用ATP生物熒光法測(cè)得選擇性培養(yǎng)牛奶中的ATP量后，就可預(yù)測(cè)巴氏殺菌奶的貨架期，這種試驗(yàn)和最近歐洲委員會(huì)介紹的保證質(zhì)量試驗(yàn)的結(jié)果一致。3.用于UHT奶和其他乳

44、制品的無菌檢測(cè)用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)無菌UHT奶耗時(shí)長(zhǎng)，等檢測(cè)結(jié)果出來后，產(chǎn)品已經(jīng)上市流通造成的影響也很難挽回。ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快檢方法可以在產(chǎn)品出廠前就得到產(chǎn)品的衛(wèi)生安全情況，而且這種方法對(duì)UHT巧克力奶特別有用。另外生物熒光檢測(cè)也常被用來檢測(cè)奶粉中的細(xì)菌總數(shù)。4.牛奶中抗生素或噬茵體殘留的快速檢測(cè)牛奶中的乳酸乳球菌和嗜酸乳桿菌，在含抗生素或被噬菌體污染的牛奶中乳酸菌的生長(zhǎng)受到了抑制，其抑制程度與抗生素含量或噬菌體污染程度有關(guān)。通過乳酸菌在牛奶中生長(zhǎng)時(shí)ATP變化的檢測(cè)，可以很快檢出牛奶中的抗生素或噬菌體的殘留，在90 min內(nèi)可檢測(cè)到低于0.005 UmL的青霉素。5.在衛(wèi)生監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用在乳

45、制品的生產(chǎn)過程中，加強(qiáng)對(duì)設(shè)備衛(wèi)生、環(huán)境衛(wèi)生、個(gè)人衛(wèi)生的管理， 可以防止產(chǎn)品的二次污染，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。利用ATP生物熒光檢測(cè)，可以在5 min內(nèi)檢出結(jié)果，及時(shí)知道清洗消毒的狀況，如果不符合標(biāo)準(zhǔn)，可以重新進(jìn)行清洗消毒。這樣就可以保證最終產(chǎn)品的質(zhì)量，起到事先控制的作用。ATP生物熒光監(jiān)測(cè)也可用來監(jiān)測(cè)奶制品生長(zhǎng)過程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，及時(shí)了解關(guān)鍵控制點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果，將事故隱患消滅在萌芽之中，從而確保產(chǎn)品的安全可靠。三、ATP熒光法細(xì)菌總數(shù)快檢方法在乳品中的應(yīng)用3.1 原奶樣品制備無菌條件下將原奶樣品稀釋適宜濃度，當(dāng)原奶中的脂肪含量不高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1.5倍按1：10用滅菌PBS溶液稀釋；當(dāng)原奶中的脂肪含量高

46、于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1.5倍按1：20用滅菌PBS溶液稀釋。3.2 UHT奶和其他要求商業(yè)無菌乳制品中菌落的富集培養(yǎng)及殘存抗菌素的中和對(duì)于低微生物污染的情況一般的富集和增殖的過程只需要二個(gè)簡(jiǎn)單步驟：把樣品用國(guó)標(biāo)法卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基稀釋成10% w/v，稀釋方法參照國(guó)標(biāo)法微生物檢測(cè)操作。乳制品和卵磷脂、吐溫80營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基10%稀釋液在32恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)。3.3 ATP熒光法檢測(cè)操作（1）按照標(biāo)準(zhǔn)化操作取50l制備好的樣品加入到ATP檢測(cè)杯中，并將ATP檢測(cè)杯置于比色杯架內(nèi)，底部鋪墊吸水紙。（2）向杯底滴加4滴TRA，用加壓器推擠液體，使含非細(xì)菌細(xì)胞的溶解物通過杯底濾膜。重復(fù)上述

47、步驟一次 (如果是花式奶一般TRA洗滌過程需要5次可洗凈糖類、食品添加劑、乳酸菌等干擾) 。（3）手持XRA試劑瓶，棄去第一滴，然后向ATP檢測(cè)杯底垂直滴加兩滿滴XRA，從過濾比色杯架取下比色杯，并放進(jìn)光度計(jì)的抽屜內(nèi)。（4）用無菌的移液器從LLR試劑瓶吸取熒光反應(yīng)試劑組50l 加入杯中，和緩地吸擠3次，混勻反應(yīng)液。保持?jǐn)D吸時(shí)間、次數(shù)一致十分關(guān)鍵。默數(shù)從LLR加入樣品直到關(guān)嚴(yán)抽屜的時(shí)間，并力求所有樣品的這段操作時(shí)間一致。（5）關(guān)上微量光度計(jì)抽屜，此時(shí)微量光度計(jì)自動(dòng)進(jìn)行熒光值測(cè)量，等微量光度計(jì)顯示出熒光值后記錄屏幕顯示的相對(duì)熒光值（RLU）。3.4國(guó)標(biāo)法：菌落總數(shù)按照GB/T4789.2-2003

48、規(guī)定菌落總數(shù)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。3.5建立工作曲線：將每一試樣同時(shí)按照國(guó)標(biāo)法和ATP法進(jìn)行檢測(cè)，以國(guó)標(biāo)法檢測(cè)的菌落總數(shù)（CFU/g）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以ATP法所得RLU值的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖并進(jìn)行線性回歸分析，得到兩種方法的相關(guān)關(guān)系，當(dāng)每一類試樣的相關(guān)系數(shù)達(dá)到一定要求（r0.8）后，將其與以往的工作曲線進(jìn)行比較并修正，等到一個(gè)較為科學(xué)的工作曲線并將回歸方程的系數(shù)添加到ATP熒光微量光度計(jì)中，用于后繼實(shí)驗(yàn)。3.6 比對(duì)試驗(yàn)：用獲得的工作曲線把各樣品在檢測(cè)時(shí)得到的RLU換算成菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值，再與該樣品用國(guó)標(biāo)方法得到的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值作相對(duì)誤差來進(jìn)行比較。3.7 添加劑影響實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)中得到的明顯偏離

49、已有標(biāo)準(zhǔn)曲線的原料乳進(jìn)行抗生素等添加劑的檢測(cè)，用以印證添加抗生素是否會(huì)引起發(fā)光值的偏離。同時(shí)某一樣品添加不同濃度的抗生素或其它乳品常見添加劑并檢測(cè)乳品中微生物的發(fā)光值。再將添加不同濃度的抗生素或其它乳品常見添加劑乳品按國(guó)標(biāo)法檢測(cè)其中含有的菌落總數(shù)。四、實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)：1. 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本系統(tǒng)配備的細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑（XRA）對(duì)于處在孢子狀態(tài)的細(xì)菌裂解率比較低，所以對(duì)奶品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)經(jīng)37溫育30分鐘使孢子活化成為營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。2. 生乳放置時(shí)間過長(zhǎng)油脂析出分層，脂肪凝結(jié)破壞生乳的自然狀態(tài)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此該儀器較適宜新鮮生乳的菌落總數(shù)檢測(cè)。3. 從冰箱取出的生乳樣品應(yīng)在室溫平衡一段時(shí)間

50、，否則可能導(dǎo)致細(xì)菌中的ATP沒有恢復(fù)到自然狀態(tài)而使檢測(cè)結(jié)果的熒光值偏低。4. 液態(tài)奶稀釋時(shí)應(yīng)充分混勻，否則影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行平皿涂布，確保涂布平皿與熒光值有可比性。5. 如在ATP熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)某一樣品多次測(cè)量其RLU值均異常高超過200萬(wàn)時(shí)，則應(yīng)再進(jìn)一步稀釋倍數(shù)，使其RLU值落在儀器最佳測(cè)量值范圍內(nèi)。6. 滴加TRA后，應(yīng)將體細(xì)胞完全排凈，否則影響最終數(shù)值。測(cè)量過程中保證光度計(jì)電量充足，否則影響數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。第二部分 ATP熒光法微生物（細(xì)菌總數(shù)）快速檢測(cè)系統(tǒng)使用說明1、技術(shù)參數(shù)及性能檢測(cè)時(shí)間1秒-99秒自由設(shè)定靈敏度5×10-18mol/L（

51、標(biāo)準(zhǔn)ATP）檢測(cè)范圍0-1010cfu/ml或10-13mol/ml-10-9mol/ml（ATP）重復(fù)誤差（批間差）±5 %數(shù)據(jù)輸出RLU（細(xì)菌細(xì)胞ATP含量）、菌落總數(shù)存儲(chǔ)媒體FLASHROM 64KB數(shù)據(jù)存儲(chǔ)數(shù)據(jù)以文件方式分類儲(chǔ)存數(shù)據(jù)內(nèi)容包括RLU（數(shù)值）、菌落總數(shù)、樣品名稱、文件名、記錄號(hào)、日期、時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)度等菌落總數(shù)換算公式可自由設(shè)定儲(chǔ)藏空間1000個(gè)數(shù)據(jù)記錄顯示方式4行漢字LCD液晶顯示數(shù)據(jù)查詢以文件記錄方式查詢連續(xù)工作時(shí)間連續(xù)工作時(shí)間大于10小時(shí)計(jì)算機(jī)連接USB接口電源充電鋰電池供電與PC連接可實(shí)時(shí)檢測(cè)并傳輸檢測(cè)結(jié)果PC機(jī)軟件數(shù)據(jù)存入ACCESS數(shù)據(jù)庫(kù)可以多種方式查詢、統(tǒng)計(jì)、匯總等；可直接將檢測(cè)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換EXCEL文件儀器尺寸165x 90 x 55 mm儀器重量0.65Kg操作溫度5 60相對(duì)濕度2080%2、儀器操作說明21 開機(jī)、初始化開機(jī)后，儀器進(jìn)行系統(tǒng)初始化，如果日期、時(shí)間沒有設(shè)置，屏幕會(huì)提示（如圖1.1），進(jìn)入主菜單工作界面。 圖1.1請(qǐng)輸入日期、時(shí)間 特別提示：日期和時(shí)間是很重要的數(shù)據(jù)。請(qǐng)參照224主菜單工作界面(如圖1.2)圖1.2 測(cè) 試