人前腦啡肽原綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建

1、    人前腦啡肽原綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建作者：李永輝1，胡伊樂1，涂心明1，臧衛(wèi)東2    作者單位：1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南洛陽 4710032.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450052     【摘要】 目的 構(gòu)建人前腦啡肽原(preproenkephalin,PENK)綠色熒光真核表達(dá)載體并進(jìn)行鑒定。方法 參照PENK基因全序列，在cDNA兩端各設(shè)計一條對應(yīng)引物，并引入各自酶切位點(diǎn)。通過RTPCR的方法從正常人腦組織中擴(kuò)增出目的基因，并定向克隆至pEGF

2、PC3綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體上。篩選陽性克隆，通過雙酶切和測序法鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果 雙酶切結(jié)果與目的基因表達(dá)的條帶完全吻合，克隆測序結(jié)果與NCBI收錄的PENK序列完全一致。結(jié)論 成功構(gòu)建pEGFPC3PENK載體，為進(jìn)一步研究疼痛的基因治療奠定基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】 綠色熒光載體;真核表達(dá);人前腦啡肽原Construction of Human PENK and Green FluorescentProtein Eukaryotic VectorLI Yonghui, HU Yile, TU Xinming, et al(Medical College, Henan University of

3、Science and Technology, Luoyang 471003, China)Abstract:Objective To construct and identify the human PENK and green fluorescent protein eukaryotic vector. Methods To correspond to the PENK gene sequences, introduce respective restriction sites in each end of cDNA; and obtain the target gene from the

4、 normal tissue of brain by RTPCR, then connect the target gene to the pEGFPC3 green fluorescent protein eukaryotic vector; and choose the positive clones to identify the recombinant plasmids by double disgestion and sequencing. Results Double disgestion results and the expression of target gene band

5、 matched completely; the clone sequencing results were the same as the sequence of PENK contained in NCBI results. Conclusion pEGFPC3PENK vector is successfully constructed for the further study of the gene therapy of pain.Key words:green fluorescent vector;eukaryotic expression; PENK癌癥晚期病人的疼痛治療是目前醫(yī)

6、療界的一項難題，傳統(tǒng)的阿片類鎮(zhèn)痛藥物雖有較好的效果，但由于其具有成癮性、呼吸抑制等副作用限制了在臨床上的使用1。20世紀(jì)80年代以后，基因技術(shù)的快速發(fā)展為疼痛的基因治療開辟了一個新時代 2，3。腦啡肽4，5是機(jī)體自身合成的一種內(nèi)源性阿片肽，無阿片類藥物的副作用且有較好的鎮(zhèn)痛作用，目前已經(jīng)成為疼痛研究的一個新方向。本實驗將人體內(nèi)控制腦啡肽合成的前腦啡肽原基因與pEGFPC3載體連接，構(gòu)建成前腦啡肽原綠色熒光真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究疼痛的基因治療奠定了基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 腦組織來源 取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院因顱腦外傷意外死亡患者的腦組織(死亡0.5 h內(nèi))。1.2 主要試劑 RNA提取試

7、劑盒cDNA 第一鏈合成試劑盒、DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購于大連寶生物公司;JM109菌、pEGFPC3質(zhì)粒由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)實驗室保存;PE4800型PCR儀產(chǎn)自美國PE公司;722型電泳儀、水平電泳槽產(chǎn)自上海醫(yī)療器械廠;其他普通試劑購于國內(nèi)各大試劑公司。1.3 總RNA的提取 無菌條件下取出腦組織，按照大連寶生物公司的總RNA提取試劑盒說明書操作，具體步驟如下：在超凈工作臺中取腦組織，在冰盒上切成約100 mg的小塊，置于1.5 mL離心管中及時使用或-80凍存?zhèn)溆?。取一塊100 mg的腦組織置于研磨器中加入液氮迅速用力研磨3

8、5次。加入450 L RLT solution，用力晃動或用槍頭吹打使其混勻，充分裂解后將裂解液吸入RNasefree的EP管中，在56水浴3 min。水浴完成后加入250 L的無水乙醇。取700 L的樣品放于2 mL收集管中的過濾柱中。置于低溫離心機(jī)中4 8 000 r/min離心1 min。倒去收集管中的廢液，加入500 L的RW solution于柱中，靜置1 min，置于4低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min。倒去收集管中的廢液，加入500 L的RPE solution于柱中，置于4低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min，重復(fù)1次。倒去收集管中的廢液，置于4低

9、溫離心機(jī)中10 000 r/min離心15 s。將濾柱放入無菌的RNasefree的1.5 mL離心管中，加3050 L DEPCH2O到柱膜中央，在50恒溫水浴鍋中放置2 min，置于4低溫離心機(jī)中10 000 r/min離心1 min，收集，分為10 L/管，-70凍存或立即使用。1.4 RTPCR 根據(jù)GenBank報道的人前腦啡肽原基因序列, 使用Primer5.0設(shè)計引物，上游和下游引物分別加上Hind和BamHI的酶切位點(diǎn)，F(xiàn)：5GAAAAGCTTATGGCGCGGTTCCTGACA3R：5GCCGGATCCTTAAAATCTCATAAATCCTC 3通過RTPCR擴(kuò)增PENK目的

10、基因。總RNA先70變性5 min，冰浴冷卻后加入反應(yīng)體系，反應(yīng)物總體積為20 L，離心混勻后，置于42恒溫水浴鍋中水浴1 h，然后移至70水浴5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，產(chǎn)物為人腦組織的總cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液5 L進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物。1.5 TPENK載體的構(gòu)建 利用膠回收試劑盒將PCR產(chǎn)物的DNA目的片段純化回收，將回收片段與T載體連接，轉(zhuǎn)染大腸桿菌 JM109，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，對陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)提取TPENK重組質(zhì)粒。1.6 pEGFPC3PENK真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 按13比例將TPENK載體和pEGFPC3載體混合后用Hind和

11、BamHI雙酶切成線狀并經(jīng)電泳回收，混合后16連接過夜，連接產(chǎn)物用42水浴熱擊法轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)菌內(nèi)鋪含Amp+的瓊脂平板，倒置37培養(yǎng)1216 h，通過菌落PCR和酶切法鑒定陽性克隆，并取PCR陽性克隆菌送上海生物工程公司測序。2 結(jié)果2.1 人前腦啡肽原基因的克隆 通過RTPCR法擴(kuò)增出的PENK基因與預(yù)測的基因基本一致(見圖1)。1：Marker 2：針對pEGFPC3設(shè)計的引物所擴(kuò)PENK基因圖1 人前腦啡肽原基因的PCR電泳圖2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序結(jié)果 從圖2中可以看出，酶切出約800 bp(PENK)和5 000 bp (pEGFPC3)的DNA片段。與理論計算一

12、致，命名為pEGFPC3PENK。測序結(jié)果與GenBank報道的序列完全吻合，載體構(gòu)建成功。1：Marker 2、3：酶切新載體所得PENK和pEGFPC3片段圖2 構(gòu)建新載體的酶切電泳圖3 討論疼痛治療是醫(yī)學(xué)界的長期研究課題。目前緩解疼痛的主要治療藥物仍是阿片類藥物，其成癮性和毒副作用大等特點(diǎn)又使其臨床應(yīng)用受限。腦啡肽是一種神經(jīng)遞質(zhì)，阿片受體的內(nèi)源性配體,通過阿片受體介導(dǎo)的抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制磷脂酰肌醇水解等細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑發(fā)揮作用。腦啡肽包括甲硫氨酸腦啡肽(MEK)和亮氨酸腦啡肽(LEK)具有鎮(zhèn)痛效果好、副作用少的優(yōu)點(diǎn)，但腦腓肽易被腦啡肽酰A或B降解成無活性的衍生物，因此找到一種持續(xù)分

13、泌內(nèi)源性腦啡肽，且具有臨床可行性的方法，成為研究的主要方向。前腦啡肽是腦腓肽的前體,在翻譯過程中經(jīng)不同的蛋白酶降解形成上述兩個具有鎮(zhèn)痛作用的活性阿片肽。前腦啡肽源基因是慢性疼痛基因治療中一種較為理想的基因選擇，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。楊茂元等6先用在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將人前腦啡肽源基因(human preproenkephalin，HPPE)轉(zhuǎn)染鼠成纖維細(xì)胞系NIH/3T3細(xì)胞，然后將該細(xì)胞移植入大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔進(jìn)而評價神經(jīng)性疼痛治療的效果，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞系NIH/3T3能表達(dá)內(nèi)啡肽基因，HPPE作為轉(zhuǎn)基因鎮(zhèn)痛治療難治性疼痛是可行的?；蜴?zhèn)痛研究中常用的載體有病毒載體與非病毒載體，病毒載體攜帶外

14、源基因和相關(guān)基因元件，并被包裝成病毒顆?？烧先氩荒芊至言鲋成窠?jīng)元細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。在體內(nèi)外實驗中使用較多，但其來源于病毒存在自身免疫原性和造成細(xì)胞病理改變等特性，其臨床應(yīng)用也受到限制7。而非病毒基因載體則以其設(shè)計靈活、低免疫原性、低毒性、低致癌性、外源基因整合幾率低、無基因插入片段大小限制、易制備、長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，成為基因治療新選擇。在國內(nèi)華中科技大學(xué)徐穎等8人，將前腦啡肽基因連接到真核載體上，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),建立四環(huán)素調(diào)控表達(dá)人前腦啡肽原基因的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞系，將來移植到體內(nèi)，可依據(jù)疼痛程度，調(diào)控疼痛基因表達(dá)時間與水平，這使得基因治療與臨床應(yīng)用又近了一步。我們在前期試驗中將增

15、強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)EGFP，鞘內(nèi)直接注射將重組質(zhì)粒注入大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔，綠色熒光顯示新構(gòu)建的質(zhì)粒雖未整合入神經(jīng)元細(xì)胞，但被蛛網(wǎng)膜下腔上皮細(xì)胞攝取并表達(dá)。隨后又將前腦啡肽原(PENK)基因與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接，鞘內(nèi)直接注射將重組質(zhì)粒注入坐骨神經(jīng)慢性壓迫模型大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔，產(chǎn)生較好和較長時間的鎮(zhèn)痛效果。為了進(jìn)一步研究前腦啡肽基因在體內(nèi)被體細(xì)胞攝取表達(dá)的部位。本實驗將人前腦啡肽基因(PENK)連接到綠色熒光載體(pEGFPC3)上，構(gòu)建pEGFPC3PENK載體，為后續(xù)疼痛基因治療的體內(nèi)外

16、實驗奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Gerra G,Maremmani I,Capovani B,et al.Longacting opioidagonists in the treatment of heroin addiction: why should we call them“substitution”J.Subst Use Misuse,2009, 44(5) :663-671.2 Glorioso JC,Fink DJ.Gene therapy for pain:introduction to the special issueJ.Gene Ther, 2009, 16(4)

17、:453-454.3 Federici T,Boulis N.Gene therapy for peripheral nervous system diseasesJ.Curr Gene Ther, 2007, 7(4):239-248.4 Pinto M,Castro AR,Tshudy F,et al.Opioids modulate pain facilitation from the dorsal reticular nucleusJ. Mol Cell Neurosci, 2008,39(4):50.5 Xu W,Sanz A,Pardo L,et al.Activation of the mu opioid receptor involves conformational rearrangement