N-甲基亞硝基脲的制備及其誘發(fā)膀胱腫瘤的作用

1、N-甲基亞硝基脲的制備及其誘發(fā)膀胱腫瘤的作用【摘要】目的研究N-甲基亞硝基脲(MNU)制備方法及其誘發(fā)大白鼠膀胱腫瘤的作用。方法由甲胺鹽酸鹽合成誘癌劑MNU，進(jìn)行大白鼠膀胱灌注2mg/次，每2周1次，共4次，以光鏡、掃描電鏡、透射電鏡等為觀察手段，對(duì)其誘發(fā)的膀胱腫瘤進(jìn)行觀察。結(jié)果8周誘發(fā)膀胱腫瘤率為100%，其組織學(xué)檢查及病理學(xué)特征與人膀胱腫瘤十分相似。結(jié)論自制的MNU誘發(fā)大白鼠膀胱腫瘤為比較理想的動(dòng)物模型.【關(guān)鍵詞】化學(xué)致癌劑；N-甲基亞硝基脲；疾病模型,動(dòng)物；膀胱腫瘤 Synthesis of N-methyl-N-nitrosourea(MNU)and development of ex

2、perimental model of bladder tumors induced by MNU in ratsLIU Hongyao,LI Xiaodong,MI Zhengguo,et al.(Department of Urology,First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China)【Abstract】 Objective To study preparation of N-methyl-N-nitrosourea(MNU)and development of the experim

3、ental animal model of bladder trmors induced by MNU in rats. Methods Bkadder tumors were induced in femal wistar rats by intravascular administration of the carcinogen,MNU that was synthesized with CH3NH2HCL.The morphological alterations in bladded epithelial cells were studied under light microscop

4、y,scanning and transmission electron microscopy. Results The administration way of a total dose of 8 mg on 4 fraction of 2 mg at 2-weekly intrvals produced a 100 % incidence of bladder tumor after 8 weeks. Histopathological characteristics of bladder tumor induced by MNU were basically similar to th

5、ose of human bladder tumor. Conclusion Intravascular administration of MNU in rats provided a useful model for experimental studies on bladder tumor.【Key words】 Carcinogen; N-mmethyl-noitrosourea; Diseases model, animal; Bladder tumor 膀胱腫瘤是泌尿外科最常見的腫瘤，人們一直努力用化學(xué)物質(zhì)建立一種較理想的膀胱腫瘤動(dòng)物模型。我們應(yīng)用自制的N-甲基亞硝基脲(MNU)成

6、功誘發(fā)了大白鼠膀胱腫瘤動(dòng)物模型，現(xiàn)報(bào)道如下。 材料與方法1.MNU的制備：(1)制備原理：CH3NH2 HCl+NH2CONH2CH3NHCONH2+NH4CL；CH3NHCONH2+HNO2CH3NCONH2+H2ONO(2)制備步驟：在200g體積分?jǐn)?shù)為24%甲胺水溶液中加入濃鹽酸和300g尿素，將溶液煮沸并回流，冷至室溫，在其中溶解110g亞硝酸鈉，冷至0。在3L燒杯中裝600g冰和100g濃硫酸的混合物，加入上述甲基尿素和亞硝酸鈉混合液使溶液溫度不超過0。MNU成結(jié)晶泡沫固體，浮在液面上，濾過，放置真空干燥。2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：選用67周齡Wistar雌性大白鼠40只。將其隨機(jī)分為2組

7、。A組(誘癌組，30只)MNU膀胱灌注2mg/次。每2周1次，共4次；B組(對(duì)照組，10只)不做特殊處理。3.實(shí)驗(yàn)方法：(1)MNU溶液的配制：以pH=6.0的枸櫞酸緩沖液為溶劑，配成濃度為20g/L。(2)MNU膀胱灌注法：常規(guī)麻醉、消毒、導(dǎo)尿后，膀胱灌注。(3)標(biāo)本采集：于第1次灌注MNU后第8周將所有大白鼠處死，完整切除膀胱，觀察大體變化，在病變明顯處取材，送光鏡及電鏡觀察。另隨機(jī)取各組5只大白鼠的其他臟器及髂內(nèi)、髂外淋巴結(jié)行組織學(xué)檢查。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用2檢驗(yàn)。結(jié)果1.一般觀察：所有灌注MNU的大白鼠，于麻醉后2.02.5h排尿，46h恢復(fù)活動(dòng)。僅A組1只導(dǎo)尿后，尿道外口溢血，3d后

8、消失。所有動(dòng)物處死前體重、活動(dòng)無明顯差別。2.病理學(xué)觀察：(1)肉眼大體觀察：B組所有大白鼠膀胱壁粘膜光滑，粉紅色，有光澤。A組所有30只大白鼠膀胱均見腫物，16只呈菜花狀，局部為褐色，8只局部粘膜隆起呈結(jié)節(jié)狀，邊界不清，質(zhì)硬，6只為米粒狀乳頭狀腫物，局部粘膜增厚。(2)光鏡結(jié)果：B組所有大白鼠膀胱粘膜上皮由23層移行上皮細(xì)胞組成，細(xì)胞扁平大小一致，排列有序，核漿比例146。A組移行上皮癌級(jí)6只，級(jí)14只，級(jí)4只，其中Ta 5只，T110只，T210只，T3 5只。除A組3只大白鼠輸尿管下端局部增厚，病理為增生及1只大白鼠左腎積水，其余各組其他臟器未見異常，淋巴結(jié)未見轉(zhuǎn)移灶。3.電鏡觀察：(1

9、)掃描電鏡：B組細(xì)胞為六角形，排列整齊，大小一致，細(xì)胞表面見細(xì)胞微嵴，高倍鏡下細(xì)胞微嵴排列整齊一致，如手風(fēng)琴樣褶皺。A組細(xì)胞排列紊亂，大小不一，微絨毛呈多形性，以球狀突起為主，末端膨大，微絨毛豐富；(2)透射電鏡：B組表層細(xì)胞為扁平狀，呈多角體，細(xì)胞核位于底部，胞質(zhì)內(nèi)有許多梭形囊泡，可連接復(fù)合體。A組細(xì)胞大，核漿比例大，核膜部分消失，可見中心粒，分裂末期核內(nèi)有核小體，細(xì)胞核畸形，胞漿內(nèi)有張力原纖維斜向依附橋粒兩側(cè)，多核仁，有邊集現(xiàn)象。討論1.MNU劑量與誘癌率及誘癌時(shí)間的關(guān)系：我們采用自制MNU多次膀胱灌注法，其癌發(fā)率為100%，與正常對(duì)照組B組相比差異有顯著性(P0.01)。與Hicks1的

10、研究相比誘癌率相同，但時(shí)間短。Serers等2報(bào)道了少量多次MNU灌入膀胱，其腫瘤發(fā)生率較大量少次灌入的顯著增高。Irving等3研究表明，MNU分次灌入膀胱內(nèi)其誘癌率與MNU總 量或灌入次數(shù)呈正相關(guān)，且誘癌需時(shí)與MNU總劑量呈負(fù)相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)MNU每次2mg無動(dòng)物死亡，總量8mg較Hicks1研究中6mg量大，誘癌需時(shí)較Hicks1研究的短，適用于短期誘癌。2.MNU膀胱灌注法：MNU分子式CH3N(NO)CONH2自發(fā)分解與溶液pH值有關(guān)2，pH=6.0時(shí)其半衰期為300min，pH=7.0時(shí)為72min。我們在本實(shí)驗(yàn)中采用pH=6.0緩沖液為溶劑，其半衰期較Hicks1采用的pH=7.0的

11、緩沖液相對(duì)長，確保MNU在膀胱內(nèi)的作用時(shí)間，增強(qiáng)了MNU的誘癌作用。我們采用麻醉后導(dǎo)尿灌入，95%的大白鼠于麻醉后2.02.5h方排尿，滿足MNU在膀胱內(nèi)保留2h，排除了Serers等2及Hicks1研究中灌入后鉗夾尿道可能造成的損傷。3.MNU誘癌的特異性及人膀胱腫瘤性質(zhì)比較：本實(shí)驗(yàn)誘癌組結(jié)果表明，除膀胱外其他臟器未見腫瘤發(fā)生，僅3只輸尿管下端局部增厚(1只管腔狹窄致腎積水)，病理檢查均為增生，考慮與返流有關(guān)，與Hicks1及Serers等2的結(jié)果一致，證明MNU膀胱灌注具有膀胱特異性。我們在本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)的膀胱腫瘤組織學(xué)形態(tài)及病理特征與人膀胱腫瘤十分相似，都來自粘膜上皮，其中移行上皮癌占80

12、%，較人類膀胱腫瘤中移行上皮癌(90%)低，與國外相同，20%為鱗癌及鱗癌與移行細(xì)胞混合較人類高(6%7%)，考慮與MNU局部刺激使細(xì)胞鱗狀化生有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)誘癌組未見腺瘤，人類膀胱癌中腺癌最少，僅占1%2%?？傊?，我們以自制MNU經(jīng)尿道膀胱灌注誘發(fā)大白鼠膀胱腫瘤模型，符合Mc Cormick等4提出的理想腫瘤模型應(yīng)具備的條件?；痦?xiàng)目：山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(971024)作者單位：劉紅耀(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科 太原，030001)米振國(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科 太原，030001)王東文(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科 太原，030001)佟錦(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科

13、太原，030001)李曉東(太原理工大學(xué)化工系)李春華(山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室)李柄太(電鏡室)參考文獻(xiàn)1，Hicks RM. Multistage cacinogenesis in the urinary bladder. Br Med Bull, 1980, 36:39-46.2，Serers NJ, Barnes SH, Wright R, et al. Induction of bladder cancer in rats by fractionated intravesicular doses of N-methyl-N-nitrosourea. Br J Cancer, 1982,45:337-350.3，Irving CC, Cox R, Murphy WM, et al. Influence of dose of N-nitrosourea on the induction of urinary bladder cancer in rats. Cancer Letter， 1979,8:3-7.4，Mc Corm