應(yīng)用PVA構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時間分辨熒光免疫試劑-醫(yī)藥衛(wèi)

1、應(yīng)用PVA構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時間分辨熒光免疫試劑-醫(yī)藥衛(wèi)    摘要 目的摘要：合成(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物，并用于構(gòu)建妊娠相關(guān)血漿蛋白A固相時間分辨免疫熒光試劑。方法摘要：用PVA作為載體結(jié)合BCPDA?Eu3+和生物素?親和素，以雙抗體夾心法原理，結(jié)合生物素標(biāo)記抗體和包被抗體建立PAPP?A時間分辨免疫熒光試劑，并進行方法學(xué)評價。結(jié)果摘要：成功的合成了活性的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物，構(gòu)建PAPP?A試劑檢測靈敏度為0.7 mIU/L；批內(nèi)變異系數(shù)在3.89%4

2、.96%之間,批間變異系數(shù)在7.35%9.27%之間。結(jié)論摘要：合成的(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物較高的反應(yīng)活性，可以用于多種試劑的構(gòu)建。構(gòu)建的PAPP?A試劑靈敏度高，具有潛伏的臨床應(yīng)用價值。 妊娠相關(guān)血漿蛋白A；固相時間分辨熒光免疫；親和素生物素聚乙烯胺4,7二氯磺苯基?1，10啡羅啉?2，9二羧酸銪復(fù)合物；唐氏綜合征Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVAAbstract 摘要:Objecti

3、ve To develop a direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+. Methods Polyvinylamine (PVA) was labeled with biotin?streptavidin and europium chelate of 4,7?bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicar

4、boxylic?acid(BCPDA). Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieve

5、d were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision (CV) was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of (SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesiz

6、ed ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.Key words摘要: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavidin?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?

7、bis(chlorosulfophenyl)?1,10?phenanthroline?2,9?dicarboxylic?acid; Down's Syndrome妊娠相關(guān)血漿蛋白A(Pregnancy associated plasma protein A，PAPP?A)是一種高分子2糖蛋白，20世紀(jì)70年代在孕婦血清中被發(fā)現(xiàn)1。在孕婦血中主要PAPP?A是胎盤滋養(yǎng)層組織分泌，它是一種異源四聚體，由兩個分子量為200 000250 000亞基構(gòu)成。PAPP?A亞基和兩個嗜紅細(xì)胞主要基礎(chǔ)蛋白(Proform of eosinophil major basic protein)以二硫鍵結(jié)合

8、而成2，在孕婦血中只存在微量游離單體PAPP?A。PAPP?A亞基由1 547個多聚核苷酸構(gòu)成，包括1個拉長的鋅指結(jié)構(gòu)，3個Linnotch重復(fù)序列，以及5個短一致重復(fù)序列3。在體內(nèi)PAPP?A是一種蛋白酶，主要針對胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(IGFBP?4)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5(IGFBP?5)起功能。胰島素樣生長因子I(IGF?I)在促進細(xì)胞*和增殖起重要功能，它主要通過IGF?1受體起功能，IGF?I、II的生物活性受6個高親和性IDFBP調(diào)節(jié)4，5。PAPP?A主要用于產(chǎn)前篩查唐氏綜合征(Down's Syndrome，DS)，迄今醫(yī)學(xué)上對此病尚無有效的治療和預(yù)防辦法，

9、只能通過產(chǎn)前篩查防止DS兒的出生，但目前開展的絨毛活檢,羊水穿刺及臍帶血穿刺均為侵進性檢查,有1%3%的流產(chǎn)率,且方法繁瑣,出報告時間長,不適宜大范圍孕婦的普查,僅限于高危人群的診斷。大量報道以為PAPP?A可作為DS胎兒產(chǎn)前篩查的的標(biāo)志物。在15周20周通過結(jié)合孕婦孕周、超聲診斷和Free?HCG可以鑒別65%75%，但要在3個月6個月結(jié)合AFP、游離E3以及抑制素上述成分可鑒別85%90%6。有文獻(xiàn)7報道PAPP?A在急性冠狀動脈綜合征(ACS)的早期診斷有一定的意義，PAPP?A在ACS患者血清含量30 mIU/L，同時結(jié)構(gòu)不同于孕婦體內(nèi)的PAPP?A且存在動態(tài)變化，必須利用超靈敏的方法

10、進行檢測。國內(nèi)PAPP?A的診斷試劑大多為ELISA和PerkinElmer公司生產(chǎn)的解離增強時間分辨熒光免疫分析(dissociated enhance lanthane time?resolved fluoroimmunoassay,DELFIA)試劑，無國產(chǎn)PAPP?A時間分辨熒光試劑。我們利用PVA(聚乙烯胺)作為載體結(jié)合BCPDA鑭系螯合物合成一種高靈敏的固相時間分辨熒光免疫分析(direct solid phase lanthane time resolved fluoroimmunoassay,DSLFIA)試劑。為進步檢測靈敏度和克服BCPDA標(biāo)記抗體使抗體失活的新題目，我們引

11、進了生物素?親和素(biotin?streptavidin system)系統(tǒng)。1材料和方法1.1材料1.2方法2結(jié)果2.1用HPLC純化(Bio)x?PVA?(BCPDA)y復(fù)合物在10 min16 min 出現(xiàn)(Bio)x?PVA?(BCPDA)y的吸收峰，沒有結(jié)合BCPDA的吸收峰在17 min24 min出現(xiàn),見圖1。圖1凈化（Bio）x聚乙烯醇（BCPDA）y在高性能液化色譜（TSK250過濾柱）上的變化圖。（略）流速控制在0.8 ml/min，吸光率325 nm2.2用滴定法確訂婚和素和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y最佳配比SA量恒定0.01 mg/ml，生物素標(biāo)記的抗體包

12、被分別濃度為0 ng/孔、0.5 ng/孔、5 ng/孔、50 ng/孔，緩沖液為pH 7.8 Tris?Hcl 0.1M，Eu3+ 10-5 M，(Bio)x?PVA?(BCPDA)y用量從40 l55 l選擇最佳值，50 l復(fù)合物熒光強度值(cpm)最佳，如圖2。圖2滴定鏈球菌，（Bio) x聚乙烯醇（BCPDA）y在10-3 M Eu3+,0.1 M Tris-Hcl buffer(pH 7.8)緩沖液中的變化，0.01 mg/ml 鏈球菌，容積變動范圍40 l55 l，觀察到最佳容積為50 l（略）2.3驗證活性用生物素化的各種濃度(0 ng/50l，0.5 ng/50l，5 ng/5

13、0l，50 ng/50l，100 ng/50l)鼠IgG包被96孔微板驗證(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物的反應(yīng)活性，在測定范圍內(nèi)成線性分布，見圖3。圖3IgG維生素定量法標(biāo)定曲線（略）2.4PAPP?A定標(biāo)曲線及靈敏度在0 mIU/L10 000 mIU/L范圍內(nèi)定標(biāo)曲線為線性分布，見圖4。S0標(biāo)準(zhǔn)重復(fù)20次檢測均值加2個標(biāo)準(zhǔn)差值代進標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出檢測限為0.7 mIU/L(數(shù)據(jù)沒顯示)。 圖4PAPP-A標(biāo)定曲線（略）2.5批內(nèi)、批間精密度對質(zhì)控血清批內(nèi)進行20次分析，批間進行12次分析，得到批內(nèi)變異系數(shù)3.89%4.96%,批間變異系數(shù)在7.35%9.

14、27%之間,見表1。表1批內(nèi)、批間變異系數(shù)比較（略）2.6回收實驗對收集樣本(P1 、P2 、P3 )依據(jù)定標(biāo)分析過程進行丈量，然后將Control1、Control2、Control3分別等體積加進P1 、P2、P3中進行多次丈量，分別計算回收率95.8%104.2%,見表2。表2回收實驗結(jié)果比較（略）3討論臨床化學(xué)家最關(guān)心的新題目是分析技術(shù)靈敏度，這也是臨床診斷試劑的核心。近來，在臨床化學(xué)檢測物質(zhì)的濃度的范圍10-3 mol/L10-16 mol/L。PCR以及其他的體外擴增技術(shù)使DNA、RNA檢測方便、高效、特異。不幸的是蛋白不能復(fù)制，最敏感的定量方法是依靠蛋白之間的特異性結(jié)合如抗原抗體

15、反應(yīng)。一個進步蛋白檢測靈敏度的方法就是信號放大，即在蛋白上標(biāo)記可以檢測的標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的信號放大而達(dá)到更輕易檢測的目的。時間分辨免疫學(xué)技術(shù)是80年代迅速發(fā)展起來的的一種公認(rèn)的最有發(fā)展前途的非放射免疫標(biāo)記技術(shù)，其中熒光鑭系螯合物具有較大的Stokes 位移(275 nm)，較窄的發(fā)射光譜(10 nm)，較長的熒光壽命(10 us1 000 us)，而被廣泛構(gòu)建時間分辨熒光免疫試劑。臨床運用最廣泛的是PE公司生產(chǎn)的解離增強鑭系時間分辨熒光免疫分析(dissociation?enhanced lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA)試劑 ，它必須使Eu3+和螯合物

16、分離，由于其信號較弱，必須加進增強液來發(fā)大信號，操縱煩瑣且在加樣的過程中可能引起外源性的污染，這些弊端影響了它的應(yīng)用。在1987年，Evangelista和Diamandis合成一種新的螯合物BCPDA，開創(chuàng)了固相時間分辨免疫熒光技術(shù)，解決了DELFIA上述新題目8，9，但是BCPDA的較大分子量、表面特性和直接標(biāo)記蛋白輕易引起蛋白的失活對它應(yīng)用帶來一些新題目，解決的辦法就是連接一個載體。我們實驗中引進了PVA作為載體，連接BCPDA和生物素?親和素。PVA直接連接蛋白技術(shù)難度較大，而生物素標(biāo)記蛋白技術(shù)比較成熟，同時親和素有4個生物素結(jié)合位點，可以起到信號放大功能，而進步檢測靈敏度。我們實驗中

17、成功的合成了(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物，用它往識別生物素標(biāo)記的抗體(見圖3)，結(jié)果顯示親和力非常高。實驗關(guān)鍵新題目是選擇SA和(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物最佳比，我們實驗中做了7個濃度梯度，選取結(jié)合后熒光強度最大的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物濃度。利用HPLC層析純后的(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物回收率是68%。通過實驗選擇最佳檢測抗體濃度、生物素化抗體濃度和標(biāo)本用量。Jackson13分析了進步靈敏度的因素即兩個關(guān)鍵的因素和終極的結(jié)合分析靈敏度相關(guān)摘要：我們監(jiān)測標(biāo)記分子(放射

18、性同位素、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團)的能力；結(jié)合試劑的質(zhì)量和實驗條件，在臨床化學(xué)存在一種誤導(dǎo)是非凡敏感的監(jiān)測方法(化學(xué)發(fā)光、時間分辨熒光)能獲得好的結(jié)果。實在這是錯誤的，假如實驗試劑和條件(抗體的親和性和特異性，固相結(jié)合物的自然特性以及清洗效率)不被選擇，很難達(dá)到理想的檢測效果。為達(dá)到較高的靈敏度，需要選擇高靈敏度的標(biāo)記技術(shù)、高親和力的試劑和最好的分析條件(可將試劑的非特異性結(jié)合降到最小)。利用鑭系螯合物的時間分辨熒光免疫分析是一種高靈敏的標(biāo)記技術(shù)，關(guān)鍵是實驗條件的選擇，我們驗證不同孵育時間下，(SA)z?(Bio)x?PVA?(BCPDA)y?Eu3+復(fù)合物產(chǎn)出率，以及和生物素化抗體的結(jié)合能力(數(shù)據(jù)不能顯示)。經(jīng)過大量的實驗選