女貞子等中藥對小鼠毛囊生長周期中生長因子mRNA表達的影響

1、    女貞子等中藥對小鼠毛囊生長周期中生長因子mRNA表達的影響        【摘要】目的探討女貞子等中藥促毛囊生長的機制。方法我們應(yīng)用RTPCR技術(shù)和凝膠密度掃描分析技術(shù)，對正常生長周期中毛囊肝細胞生長因子(HGF)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)mRNA表達水平，以及女貞子等中藥對體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊HGF和VEGFmRNA表達水平的影響進行了深入的研究。結(jié)果我們的研究發(fā)現(xiàn)正常毛囊生長周期中，生長期毛囊有明顯的HGF和VEGFmRNA表達，而退行/休止期毛囊則很難檢

2、測出上述因子mRNA的表達。在毛囊生長發(fā)育的過程中，HGF和VEGFmRNA表達也逐漸減弱。與女貞子混合培養(yǎng)的毛囊，在培養(yǎng)的第6天仍有相當量的HGF和VEGFmRNA表達，而相應(yīng)的對照組則未能測到這些因子的表達。而與齊敦果酸培養(yǎng)的毛囊在培養(yǎng)的第6天僅有HGFmRNA表達，而無VEGFmRNA的表達。結(jié)論女貞子及齊敦果酸可促進體外培養(yǎng)的毛囊對HGF和(或)VEGFmRNA的表達。從而從分子生物學水平揭示了上述藥物促進毛囊生長的可能機制?！娟P(guān)鍵詞】毛囊肝細胞生長因子內(nèi)皮生長因子女貞子Expression of Growth Factor mRNA in Hair Follicles Culture

3、d with Some Chinese HerbsFAN WeixinZHUWenyuan.（Department of Dermatology. The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029）【 Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of hair growth stimulated by some Chinese herbs. Methods Expression of hepatocyte growth

4、factor (HGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA was detected by RTPCR in normal hair cycles and in hair follicles cultured with some Chinese herbs. Results Expression of HGF and VEGF mRNA varied in normal mouse vibrissa follicles during hair growth cycles. HGF and VEGF mRNA were dete

5、ctable in anagen follicles, but not in catagen/telogen follicles. The expression of HGF and VEGF mRNA decreased gradually in the follicles from very early anagen to late anagen. At the sixth day the expression of HGF and VEGF mRNA was still detectable for the group in which the follicles were cultur

6、ed with Ligustrum lucidum(A), but not for control group. At the sixth day HGF mRNA expressed only when the follicles cultured with olianolic acid, an active ingredient of Ligustrum lucidum. Conclusion The results demonstrate that there is varying expression of HGF and VEGF mRNA in the hair growth cy

7、cles of mouse vibrissa follicles.Ligustrum lucidum (A) is shown to up? regulate the expression of HGF and VEGF in mouse vibrissa follicles culture model. 【 Key words】 Hair follicles Hepatocyte growth factor Endothelial growth factor Fructus ligustri lucidi肝細胞生長因子(HGF)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)是新近發(fā)現(xiàn)于毛乳頭的兩個生長因

8、 子。他們是由生長期毛囊的毛乳頭分泌，并對毛發(fā)生長有明顯的促進作用1,2。為了解 它們在整個毛囊生長周期中的動力學改變，我們通過RTPCR和半定量RTPCR技術(shù)，對 生長周期不同階段毛囊HGF和VEGF的 mRNA表達水平進行動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)在生長周期的不同階段，毛囊HGF和VEGF的mRNA表達 水平有明顯變化。我們還研究了某些促毛發(fā)生長藥物與毛囊HGF和VEGFmRNA表達的關(guān)系。現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。 材料和方法 一、實驗動物 小鼠觸須毛囊取自出生3565d近交系C57BL/6J小鼠，雄鼠24只，雌鼠29只。具體培養(yǎng)方法 同文獻3。 二、毛囊生長周期中VEGF和HGFmRNA表達的研究 1

9、.實驗分組:實驗分6組，每組20個毛囊,分組依據(jù)同文獻4。他們分別是生長期毛 囊；生長期毛囊；生長期毛囊；生長期毛囊；退行期/休止期毛囊；陰性 對照組（毛囊間結(jié)締組織）。 2.總RNA提取：分離的毛囊立即放入1mLTrizol（購于生命技術(shù)公司）中，總RNA提取嚴格 按照試劑盒說明步驟進行5。 3.RTPCR：采用一步法RTPCR放大系統(tǒng)（AccessRTPCRSystem）試劑盒（購于Promega公 司）。特異性針對小鼠VEGFmRNA的一對引物的序列分別為5' CAGGCTGCTGTAACGATGAA3'和5'AATGCTTTCTCCGCTCTGAA3'。

10、擴增產(chǎn)物為207bp6。特異性針對小鼠HGFmRNA的一對引物序列為5'CCATGAATTTGACCTCTATG3'和5' ACTGAGGAATGTCACAGACT3'，擴增產(chǎn)物為278bp7。RTPCR在PERKINELMER2400上完成。詳細 步驟見Schroppel等6和Yang等7的研究。RTPCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為2瓊脂糖凝膠上電泳 ，溴乙啶染色。凝膠掃描，象打印。 4.內(nèi)參照:研究中設(shè)立陰性對照，為保證實驗的準確性，反應(yīng)體系中還加入針對小鼠 肌動蛋白mRNA的特異性引物作為內(nèi)參照來證實標本中mRNA已被完整的提出，同時還可 作為半定量RTPCR的內(nèi)參

11、照物。 5.RTPCR反應(yīng)產(chǎn)物的定量：RTPCR擴增后的產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為2瓊脂糖凝膠電泳后， 溴乙啶染色，紫外線下對凝膠進行密度掃描，從而得出各陽性條帶的絕對密度。該工作 在美國基因公司生產(chǎn)的密度掃描儀上進行。 三、中藥及其單體對體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊中VEGF和HGFmRNA表達水平的研究 女貞子、黃芪和白芷的培養(yǎng)質(zhì)量濃度為2.5mg/mL，齊敦果酸培養(yǎng)質(zhì)量濃度為130g/mL。 陰性對照組為單純毛囊培養(yǎng)。每組20個毛囊，分別培養(yǎng)2d、4d和（或）6d。毛囊分離、 總mRNA提取、RTPCR、電泳、溴乙啶染色、凝膠掃描定量等同前。 結(jié)果     1毛囊各

12、生長周期血管內(nèi)皮細胞生長因子mRNA表達RTPCR電泳結(jié)果 四、黃芪、白芷和齊敦果酸對體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊VEGFmRNA表達影響 培養(yǎng)的第2天，各組都有207bp的VEGFmRNA表達，與陰性對照之間無明顯差異。培養(yǎng)第 6天，各組與對照組一樣，都未檢測到VEGFmRNA表達。各標本中都有500bp肌動蛋白 mRNA表達。 五、中藥及其單體對體外培養(yǎng)小鼠觸須毛囊HGFmRNA表達的影響 各組毛囊標本均可見肌動蛋白特異性mRNA表達。培養(yǎng)第2天，與女貞子、黃芪、白 芷、齊敦果酸培養(yǎng)的毛囊和單純培養(yǎng)的毛囊（陰性對照組）均有明顯的278bpHGF mRNA表達（鏈A,C,E,G,I）。但培養(yǎng)到第6天

13、，女貞子組、齊敦果酸組仍有一定量的HGF mRNA表達（鏈B,H），而黃芪、白芷和對照組則未能檢測到HGFmRNA的表達（鏈D,F,J） 。RTPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的凝膠密度掃描定量分析顯示，培養(yǎng)的第6天，女貞子組和齊敦 果酸組HGF/肌動蛋白的密度比值明顯高于相應(yīng)的陰性對照組（P<0.01）。 討論 我們通過RTPCR技術(shù)，對小鼠觸須毛囊生長周期HGF和VEGF的動態(tài)變化進行了研究，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)它們在毛囊的生長期各階段都有明顯的表達，而在退行期/休止期幾乎沒有表達。 即使在毛囊的生長期的不同階段，其表達的程度也不一樣。生長期的早期毛囊（生長期 和生長期）HGF和VEGFmRNA表達較多。隨

14、著生長期毛囊不斷生長發(fā)育成熟，到 生長期中期和晚期HGF和VEGFmRNA表達逐漸減少。這就進一步證實了HGF和VEGF對毛囊 生長周期和毛發(fā)生長正相調(diào)節(jié)的重要性。 動物實驗發(fā)現(xiàn)女貞子使小鼠耐缺氧能力增加，并有抗衰老作用。以往的研究中我們發(fā)現(xiàn) 女貞子在小鼠觸須毛囊體外培養(yǎng)中能明顯促毛發(fā)生長。進一步用其主要活性成分齊敦果 酸進行毛囊體外培養(yǎng)研究，也發(fā)現(xiàn)該單體對毛囊生長有明顯促進作用。但女貞子以及齊 敦果酸促進毛發(fā)生長的機制目前還不清楚。本研究中發(fā)現(xiàn)女貞子能使培養(yǎng)的毛囊VEGF和 HGFmRNA表達上調(diào)，表達時相明顯延長。由此可以推測，女貞子促毛發(fā)生長的機制之一 是通過促進毛乳頭VEGF和HGF的

15、分泌而促進毛囊生長。有趣的是女貞子的主要有效成分 齊敦果酸只上調(diào)體外培養(yǎng)的毛囊HGFmRNA的表達，而未表現(xiàn)出對VEGFmRNA表達。這就在分子水平給我們兩個重要提示： 齊敦果酸是女貞子中促進毛發(fā)生長重要的有效成分，它通過促進毛乳頭HGFmRNA表達而 促進毛發(fā)生長。女貞子中還有其它有效成分通過促進毛乳頭分泌VEGF和(或)HGF而促進 毛發(fā)生長。 黃芪的主要成分是黃芪皂甙類、多糖類和黃酮類。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)黃芪對體外培養(yǎng) 的小鼠觸須毛囊有明顯的促生長作用，但在用黃芪的主要活性成分黃芪總甙做小鼠觸須 毛囊體外培養(yǎng)中未見明顯促毛發(fā)生長作用。黃芪促毛發(fā)生長的機理目前還不清楚，研究 發(fā)現(xiàn)黃芪能明顯

16、延緩人胚肺二倍體細胞自然衰老的進程，延長細胞壽命達1/3左右。在人 和鼠的胚腎細胞培養(yǎng)中加入0.5的黃芪后，活細胞數(shù)明顯增多，細胞生長旺盛，細胞在 體外的生長壽命延長1倍左右。本研究中發(fā)現(xiàn)黃芪不能上調(diào)體外培養(yǎng)毛囊對HGF和VEGF mRNA的表達。但有研究發(fā)現(xiàn)黃芪煎劑對血漿和細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥 苷（cGMP）的濃度有明顯影響,從而使cAMP/cGMP的比值發(fā)生變化。那么黃芪促毛發(fā)生長 是否通過改變毛囊細胞的cAMP和cGMP的含量的機制有待進一步的研究。江蘇省中醫(yī)藥管理局和省科委資助作者單位：范衛(wèi)新（210029南京，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科）朱文元(210029南京

17、，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科指導(dǎo)者)參考文獻348.1999,28:8083.30.4Stenn KS, Prouty SM, Seiberg M. Molecules of the cycling hair follicle a tabulated review. J Dermatol Sci, 1994, 7 Suppl: S109 S124. 5Chomczynski P. A reagent for the single step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques, 1993, 15: 532 537. 6Schroppel B, Huber S, Horster M, et al. Analysis of mouse glomerular podocyte mRNA b