山羊血管內皮細胞生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫分析

1、山羊血管內皮細胞生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產品編號：CSB-E12814G檢測范圍：12.5 pg/ml - 800 pg/ml最低檢測限：3.12 pg/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的山羊VEGF，且與其他相關蛋白無交叉反應。有效期：6個月預期應用：ELISA法定量測定山羊血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清或其它相關生物液體中VEGF含量。說明 1試劑盒保存：-20（較長時間不用時）；2-8（頻繁使用時）。2濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。 3中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有

2、少許水樣物質，此為正?，F象，不會對實驗結果造成任何影響。概述血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在胚胎發(fā)生和創(chuàng)傷愈合過程中啟動血管形成的一個高度特異的有絲分裂原，也是一種有效的血管通透性誘導因子。VEGF是胱氨酸結生長因子超家族的一員，主要由垂體中濾泡星形細胞產生，能誘導血管生成，其作用沒有種屬特異性。血管內皮細胞可作為檢測VEGF促細胞增殖實驗的靶細胞。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗VEGF抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗VEGF抗體、HRP標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物TMB顯色。

3、TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的VEGF呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。 試劑盒組成及試劑配制 1. 酶聯(lián)板(Assay plate )：一塊（96孔）。 2. 標準品（Standard）：2瓶(凍干品)。3. 樣品稀釋液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。4. 生物素標記抗體稀釋液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。5. 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 （HRP-avidin Diluent）：1×10ml

4、/瓶。6. 生物素標記抗體（Biotin-antibody）：1×120l/瓶（1：100）7. 辣根過氧化物酶標記親和素（HRP-avidin）：1×120l/瓶（1：100）8. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 9. 濃洗滌液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。 10. 終止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。需要而未提供的試劑和器材1. 標準規(guī)格酶標儀2. 高速離心機3. 電熱恒溫培養(yǎng)箱4. 干凈的試管和Eppendof管5. 系列可調

5、節(jié)移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標本的采集及保存 1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20或-80保存，但應避免反復凍融。2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或將標本放于-20或-80保存，但應避免反復凍融。3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20或-80保存，但應避免反復凍融。注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢

6、測。標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了“N”倍，標本的濃度應再乘以“N”。標準品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為800 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋800 pg/ml，400 pg/ml，200 pg/ml，100 pg/ml，50 pg/ml，25 pg/ml，12.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內配制。如配制

7、400 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）800 pg/ml的上述標準品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2ml。如10l生物素標記抗體加990l生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100l），實際配制時應多配制0.1-0.2

8、ml。如10l辣根過氧化物酶標記親和素加990l辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。操作步驟實驗開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100l，余孔分別加標準品或待測樣品100l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2.

9、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100l（取1l生物素標記抗體加99l生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37,60分鐘。3. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。 4. 每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液） 100l，37，60分鐘。5. 溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，200l/每孔，甩干。6. 依序每孔加底物溶液90l，37避光顯色（30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔顯色不明顯，即可終止）

10、。7. 依序每孔加終止溶液50l，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內進行檢測。注：1. 用戶在初次使用試劑盒時，應將各種試劑管離心數分鐘，以便試劑集中到管底。2. 每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調OD值至零。 3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內，酶標板加上蓋或覆膜。4. 未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8保存。標

11、準品、生物素標記抗體工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。請勿重復使用已稀釋過的標準品、生物素標記抗體工作液、或辣根過氧化物酶標記親和素工作液。5. 建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。 注意事項1. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。2. 洗滌過程非常重要，