流動相的離子強度對RP(1).

1、流動相的離子強度對 RP(1)在反相高效液相色譜（RPHPLC過程中，流動相的離子強度可顯著影響可解離的 化合物如抗生素的色譜峰形，原因在于流動相的離子強度較低時，色譜填料的 固定相易于過載，使離子化的化合物的色譜峰形呈典型的過載特征一一峰形接 近直角三角形。隨著進樣量的增加，色譜區(qū)帶中高濃度的前半部的保留時間減 少，但色譜區(qū)帶均在同一時刻結(jié)束，色譜峰的拖尾因子及峰寬均顯著增加，同 時被測物與有關(guān)物質(zhì)間的分離也隨之變差。選擇合適的緩沖鹽并適當(dāng)?shù)卦黾恿?動相的離子強度即可顯著改善抗生素的色譜峰形，色譜峰的拖尾因子及峰寬均 隨之降低，同時被測物與有關(guān)物質(zhì)間也更加易于分離。關(guān)鍵詞： RPHPLC；

2、抗生素； 色譜峰形； 流動相； 離子強度Influence of the ionic strength of mobile phase on peak shape of antibiotics in RPHPLCABSTRACT The ionic strength of mobile phase can significantly affect the peak shape of ionogenic compounds such as antibiotics in reversedphase high performance liquid chromatography （RPHPLC）. T

3、he influence may be attributed to overloading of ionogenic analytes in lower ionic strength mobile phase. In such phase, peak becomes increasingly rightangled triangle in shape with increasing sample load together with increasing peak width and tailing. The retention time of the highconcentration fr

4、ont decreases with increasing sample load, while the end of the peak tail has a constant retention time, equal to the symmetrical analytical peak. Due to considerably worse peak shapes, poorer resolution between the main component and its related substances might be observed. With the optimal buffer

5、 and the increase of ionic strength, significant improvement in peak shape of antibiotics could be achieved and consequently a decrease in the tailing factor, an increase in the apparent column efficiency as well as an efficient resolution were obtained.KEY WORDS RPHPLC; Antibiotics; Peak shape; Mob

6、ile phase; Ionic strength據(jù)統(tǒng)計，約 80%的藥物含有堿性官能團，故堿性化合物的反相高效液相色譜（RPHPLC行為在色譜學(xué)界始終是一個引人注目的研究課題，而具有不同pKa值的堿性藥物的RPHPL（分離在藥學(xué)界的重性正日益被關(guān)注1。然而，由于 堿性化合物的保留可隨著流動相 pH值的不同而產(chǎn)生顯著的變化，因而它們的RPHPL分離通常具有一定的難度。在某些 pH范圍內(nèi)，堿性化合物的色譜峰拖 尾，表觀柱效(理論板數(shù)，n)較低，其原因可能包括色譜柱的過載、堿性化合物 與填料表面殘余硅醇基的相互作用以及較慢的吸附解吸附動力學(xué)等。絕大多數(shù) 抗生素同時含有堿性和酸性基團，多為親水性的兩

7、性化合物，故其RPHPL行為遠較通常的堿性化合物更為復(fù)雜。我們在應(yīng)用現(xiàn)行各國藥典24進行抗生素RPHPL(分析時發(fā)現(xiàn)，有些抗生素的色譜峰形異常一一峰形展寬并接近直角三 角形，色譜峰的拖尾因子及峰寬均較大，有時甚至影響到被測物與有關(guān)物質(zhì)間 的分離。囿于目前的填料制造水平，以硅膠為基質(zhì)的反相鍵合相填料的表面實 際上是不均勻的，固定相中不可避免地含有少量高能量位點 (sites) ，這些高能 量位點易為可解離的 ( 甚至中性的 ) 化合物所過載 (overloading) 5， 6。此 外，解離的化合物在固定相表面的相互排斥作用以及較難滲透進入疏水性的固 定相中也是可能的原因 7。眾多實驗結(jié)果已經(jīng)證

8、實，在線性色譜 (linear chromatography)領(lǐng)域，采用RPHPL(分離可解離的(尤其是堿性的)化合物時色 譜柱易于過載，甚至低達10ng(相當(dāng)于10-6，進樣10卩I)的堿性化合物也可使 常規(guī)色譜柱(150mm< 46mm的表觀柱效明顯降低；減少進樣量則可改善色譜峰形 并使表觀柱效顯著增加；過載效應(yīng)可隨著流動相的離子強度 (c) 的增加而逐漸減 弱812。本課題選取了幾個具有代表性的抗生素品種，初步研究了流動相 的離子強度對RPHPL(中抗生素色譜峰形的影響。1 儀器與試藥美國Agile nt 1100 型HPLC儀。色譜柱：頭抱呋辛為美國 Discovery C18(

9、250mr« 46mm 5卩m)，頭抱哌酮和青霉素 G為英國Hypersil BDS C18(250mrX 40mm 5 卩 m)，克林霉素為日本 TSK GEL 0DS100S(150mmt6mm 5卩m)。頭抱呋辛鈉、頭抱哌酮鈉、頭抱哌酮 S異構(gòu)體、頭抱哌酮降解物B、鹽 酸克林霉素和青霉素G鉀對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。乙酸鈉、 乙酸、氯化鈉、氫氧化鋰、氫氧化鉀、氨水、甲酸鈉、甲酸、三乙胺、磷酸二 氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸和高氯酸鈉均為分析純，乙腈和甲醇均為HPLC級，水為蒸餾水。應(yīng)用PeakMaster 5.1軟件(Charles大學(xué))計算流動相的離子強度。2 色譜條件

10、和測定方法 流動相的組成以及供試品液的濃度見結(jié)果與討論；檢測波長：頭抱呋辛和 頭抱哌酮為254nm克林霉素為214nm青霉素G為220nm柱溫30C。流速： 頭抱呋辛為15ml/min，頭抱哌酮為12ml/min，克林霉素和青霉素G為 10ml/min。進樣體積：頭抱呋辛為20卩l(xiāng)，頭抱哌酮、克林霉素和青霉素 G為 10卩l(xiāng)。以流動相作頭抱呋辛鈉、頭抱哌酮鈉和鹽酸克林霉素的溶劑，以水作青 霉素G鉀的溶劑。3 結(jié)果與討論已知在低pH值的流動相中，以所謂“B型”高純度硅膠為基質(zhì)的反相鍵合 相填料的表面幾乎不存在離子化的硅醇基，這使得殘余硅醇基對被測物的保留 和過載行為的影響極小 10， 11，故本

11、課題主采用這類金屬殘留量極低、酸Discovery C18 、 Hypersil BDS C18 和 TSK性硅醇基含量最少的惰性填料GEL ODS100S3.1頭抱呋辛中國藥典(ChP) 2a測定頭抱呋辛鈉中頭抱呋辛含量的 RPHPL係統(tǒng)是參考美國藥典(USP)和英國藥典(BP) 3a, 4a制訂的，主區(qū)別 在于ChP選用C18柱代替USP規(guī)定的己基硅烷鍵合硅膠(C6)柱，而流動相則均 為乙腈：pH34乙酸鹽緩沖液(含5mmol/L乙酸鈉和01mol/L乙酸)(1 : 10)，頭 抱呋辛(羧基的pKa值為25 13)在流動相中大部分呈解離狀態(tài)并荷負電。由 于ChP規(guī)定采用較大的進樣量(05m

12、g/ml，約11mmol/L, 20卩l(xiāng))，使頭抱呋辛峰 具有典型的過載特征512，14峰形接近直角三角形。隨著進樣量的增 加，色譜區(qū)帶中高濃度(C)的前半部的保留時間(tR)相應(yīng)減少，但色譜區(qū)帶均在 同一時刻結(jié)束(Fig.1A，Tab.1)。這種色譜峰形在色譜學(xué)界通常稱之為過載拖尾 (overload tailing) 或非線性拖尾 (nonlinear tailing) 。過載使頭抱呋辛峰的 拖尾因子(T)和峰寬均顯著增加，頭抱呋辛與有關(guān)物質(zhì)間的分離也相應(yīng)變差。另 選用其他 C18柱(Kromasil C18、Zorbax C18、Inertsil ODS3 、Hypersil BDS C

13、18 TSK GEL ODS100SShimpack CLCODS口 LiChrospher 100 RP18e)、C8柱 (Kromasil C8 、 Inertsil C83、 Hypersil BDS C8 、 Shimpack CLCC8、 TSK GELC8和Discovery C8)和C4柱(SinoChrom C4)實驗，結(jié)果也如此。如選用 C6柱 則可得最為對稱的色譜峰形 15，且頭抱呋辛峰無過載特征 (Fig.1B) 。國內(nèi) 另有研究表明，頭抱呋辛的峰形與填料的品牌也即填料的制造工藝有關(guān)，選用 某些品牌的填料如 Spherisorb C18 可得較為對稱的峰形 16，在我們的

14、實驗 中也得到證實。由此可見，雖然所用流動相的緩沖容量較低(乙酸的pKa值約為4717a )，但頭抱呋辛在大多數(shù)類型的色譜柱上易于過載并非由于緩沖液過 載(buffer overload)所致，而可能源于這類色譜柱對離子化的化合物的飽和容量相對較低。作者：劉浩 王紅武 丁建英 仇仕林 【關(guān)鍵詞】 ,RP 摘在反相高效液相色譜(RPHPLC過程中，流動相的離子強度可本篇論文是由3COM文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站 的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否 者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。Fig.1 (略)最近的研究結(jié)果712，182

15、7顯示，應(yīng)用RPHPL(分離可解離的化合 物時，流動相中添加緩沖鹽并非僅僅用于穩(wěn)定流動相的pH值，緩沖鹽、甚至簡單的中性鹽的反離子還可與離子化的被測物通過相互間的締合作用形成疏水性 較強的中性離子對復(fù)合物；在低離子強度的緩沖液中，吸附在固定相表面的離 子化的被測物分子的極性基團相互之間存在靜電排斥效應(yīng)，這使得色譜柱的飽和容量顯著降低；隨著緩沖液濃度 （離子強度 ）的增加，中性離子對復(fù)合物的濃 度相應(yīng)增加，固定相表面離子化的吸附物之間的相互排斥作用隨之減弱，導(dǎo)致 色譜柱的飽和容量、尤其是填料上的低能量位點 （ 與溶質(zhì)和鍵合相的烷基鏈之間 的相互擴散作用有關(guān) ） 的飽和容量以及平衡常數(shù)增加；鹽一類

16、的流動相添加劑可 破壞離子化的被測物在流動相中的溶劑化去溶劑化平衡，產(chǎn)生所謂的促溶效應(yīng) （chaotropic effect） ，被測物與鹽相互作用，離子化的被測物相互間的排斥作 用減弱，從而顯著地影響被測物在固定相上的吸附行為；在制備色譜系統(tǒng)中或 被測物濃度較高時，流動相中應(yīng)含有足量的緩沖鹽以改善色譜峰形和分離效 果。根據(jù)文獻812, 1827,在流動相中添加中性鹽如氯化鈉或增加緩沖 液的濃度 （ 均使離子強度增加 ） 后，頭孢呋辛的峰形顯著改善，拖尾因子降低， 表觀柱效增加,其保留時間受進樣量的影響變小,且緩沖液的濃度越高,效果 越明顯。有研究表明,色譜柱的飽和容量可隨緩沖鹽的單價陽離子（

17、如 Na 、K 、Cs ） 直徑的增加而降低 18,故分別以 NH 4、 K 、Li 代替 Na 進行了實 驗。選用 Na ,色譜柱的飽和容量相對較高。流動相中如含 10%乙腈,則乙酸的 pKa值可由47增至49 2830;流動相的表觀pH值通?？呻S著乙腈濃度的 增加而相應(yīng)增加，且表觀pH值的變化與緩沖鹽的種類、濃度以及最初的 pH值 等均相關(guān) 28, 29。顯然,現(xiàn)行藥典的流動相的緩沖容量較低,流動相中的 乙酸只有極少量以解離的形式存在,如欲增加緩沖液的濃度,則緩沖液中需添 加高濃度的乙酸,這使得乙酸可能作為強洗脫劑成分,改變色譜系統(tǒng)的選擇 性。因此,緩沖鹽改用與乙酸性質(zhì)類似但更為適宜的甲酸

18、鹽 （pKa 值約為 3717b），同時流動相進一步優(yōu)化為乙腈：pH34甲酸鹽緩沖液（含80mmol/L甲 酸鈉和014mol/L甲酸）（1 : 9），則可得較好的色譜峰形（Fig.lC）。另用其他 C18柱（Kromasil C18、Hypersil BDS C18 和 TSK GEL ODS100球驗，亦可得 顯著改善的色譜峰形。眾所周知，保留值 （如容量因子 k） 反映了被測物在固定 相和流動相中的量之比，故過載行為對保留值較大的組分更易于發(fā)生 11。 實驗結(jié)果也證實，隨著流動相中乙腈濃度的增加，頭孢呋辛的保留時間減少， 色譜峰的對稱性進一步改善 （乙腈濃度為 15%時，理論板數(shù)不增反降

19、則是由于保 留時間較少時，表觀柱效受柱前死體積的影響相對較大所致 ） 。3.2頭抱哌酮ChP2b測定頭抱哌酮鈉中頭抱哌酮含量的 RPHPL系統(tǒng)是 參考USP 3b制訂的，ChP和USP的流動相均為乙腈：pH44乙酸鹽緩沖液（含 12mmol/L三乙胺和4mmol/L乙酸）（12 : 88）; BP 4b的流動相為乙腈：pH44 乙酸鹽緩沖液（含25mmol/L三乙胺和6mmol/L乙酸）（11 : 89）。 ChP采用較大的 進樣量（05mg/ml，約07mmol/L, 10卩l(xiāng)），頭抱哌酮及其S異構(gòu)體的色譜峰均具 有典型的過載特征，降解物B（中性化合物）的峰形則非常對稱（Fig.2A）。另選

20、 用其他 C18柱（Kromasil C18、Inertsil ODS3 、TSK GEL ODS100和 LiChrospher 100 RP18e）實驗，結(jié)果也如此。國內(nèi)許多實驗室證實，ChP方法對色譜柱的求比較苛刻，即使降低進樣量也僅有少數(shù)品牌的色譜柱符合國外藥 典對系統(tǒng)適用性的求（USP: T< 15，BP n5000）;選用BP流動相則色譜柱的 選擇范圍相對較寬；ChP色譜系統(tǒng)的平衡所需時間較長；采用某些品牌的色譜 柱，頭抱哌酮的保留時間的重現(xiàn)性較差;選用不同品牌的填料，頭抱哌酮及其 主雜質(zhì)的洗脫順序可能不同。三乙胺在 HPLC早期主作為掃尾劑以改善色譜峰 形，隨著最近十多年來

21、填料制造工藝的改進以及所謂惰性填料的廣泛應(yīng)用，三 乙胺在現(xiàn)代HPLC中已很少采用。三乙胺在 ChP色譜系統(tǒng)中還可作為疏水性較弱的離子對試劑影響頭孢哌酮的保留，隨著流動相中三乙胺濃度的增加，頭孢哌 酮的保留時間相應(yīng)減少 31。流動相中離子對試劑的濃度一般應(yīng)不低于 5mmol/L,否則色譜系統(tǒng)的平衡所需時間較長，且離子化的化合物的保留值的重 現(xiàn)性可能較差。采用無緩沖液或緩沖容量極低的流動相時，可解離的化合物的 色譜峰可隨著進樣量的增加而展寬甚至裂分21, 3234。在含12%-18%乙 腈的流動相中，乙酸的pKa值由47增至約51 2830。顯然，ChP色譜系統(tǒng) 的緩沖容量極低,緩沖液的濃度與供試

22、品液的濃度接近,較高濃度的供試品液 進入色譜系統(tǒng)后，頭孢哌酮在流動相中的二次化學(xué)平衡會導(dǎo)致色譜區(qū)帶處的流 動相pH值發(fā)生微小變化，影響頭抱哌酮的可解離基團的離子化，即頭抱哌酮在 色譜區(qū)帶的每一點處的離子化程度取決于其本身的濃度，而頭孢哌酮的不同離 子化形式的保留是不同的，結(jié)果導(dǎo)致緩沖液過載7頭抱哌酮峰展寬，保 留值重現(xiàn)性差。如采用 1/10 的進樣量，則頭抱哌酮的峰形顯著改善，但仍呈現(xiàn) 過載特征，仍較難符合國外藥典的求。在流動相中添加中性鹽后，頭抱哌酮的 峰形顯著改善，拖尾因子和峰寬均降低，其保留時間受進樣量的影響變小，且 鹽的濃度越高，效果越明顯。參考 ChP2005和文獻31，將乙酸鹽緩沖

23、液的 pH值降至30,雖然離子強度僅稍增加，但頭抱哌酮的峰形顯著改善，只是仍稍 具過載特征 (Fig.2B) 。這是因為在含有乙腈的流動相中，化合物的酸性基團的 pKa值會隨著乙腈濃度的增加而相應(yīng)增加30, 31，故pH30時，頭抱哌酮的 羧基pKa值為 23( 01 03.htm)在流動相中的解離被抑制，吸附在固定相表面的、羧基解離的頭抱哌酮分子顯著減 少，頭抱哌酮分子相互間的靜電排斥效應(yīng)相應(yīng)降低，使色譜柱的容量、表觀柱 效以及頭抱哌酮的保留時間均隨之增加。鑒于 ChP2005流動相的緩沖容量仍較 低，流動相中的乙酸只有極少量以解離的形式存在，故緩沖鹽改用更為適宜的 甲酸鹽，同時棄用會使保留

24、機理復(fù)雜化的三乙胺，選用乙腈：pH30甲酸鹽緩沖液(含40mmol/L甲酸鈉和018mol/L甲酸)(18 : 82)為流動相時，可得較好的色 譜峰形和分離效果 (Fig.2C) ；隨著緩沖液濃度的進一步增加，色譜峰形進一步 改善；甚至進樣量增加 1 倍，也未見拖尾因子和峰寬有顯著的增加。另用其他 C18柱(Kromasil C18、LiChrospher 100 RP18e、Discovery C18、Hypersil BDS C18和TSK GEL ODS100S實驗，亦可得顯著改善的色譜峰形和分離效果。 但值得注意并令人困惑的是，僅僅將乙酸鹽緩沖液的pH值降至30并添加約16mmol/L

25、 NaCl，卻可得最佳的色譜峰形。作者：劉浩 王紅武 丁建英 仇仕林 【關(guān)鍵詞】 ,RP 摘在反相高效液相色譜(RPHPLC過程中，流動相的離子強度可本篇論文是由3COM文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站 的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否 者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。Fig.2 (略)3.3克林霉素ChP2c測定鹽酸克林霉素中克林霉素含量的 RPHPL係統(tǒng) 與BP和USP3b, 4b不同，ChP的流動相為甲醇：pH30磷酸鹽緩沖液(含 25mmol/L磷酸二氫銨4mmol/L磷酸)(45 : 55)，BP和USP的流動相為乙

26、 腈：pH75磷酸鹽緩沖液(含50mmol/L磷酸二氫鉀和40mmol/L氫氧化 鉀)(42 : 58)。 ChP采用與BP相同的進樣量，但克林霉素峰具有典型的過載特 征(Fig.3A)。另選用其他 C18柱(Kromasil C18、Inertsil ODS3 、Hypersil BDS C18 Discovery C18、Shimpack CLCODS口 LiChrospher 100 RP18e)實 驗，結(jié)果也如此。如選用BP的色譜系統(tǒng)，則克林霉素的峰形較為對稱，表觀柱 效亦較高(Fig.3B)。參考BP的色譜系統(tǒng)，以甲醇代替乙腈，并適當(dāng)增加甲醇的 濃度以使克林霉素具有幾乎相同的保留時間

27、，則流動相的離子強度減半，拖尾 因子和峰寬僅稍增加；在 ChP的流動相中添加中性鹽或緩沖液濃度增加 1倍， 拖尾因子顯著降低，但表觀柱效亦相應(yīng)降低；如流動相的緩沖液濃度增加 4 倍，則峰形明顯改善，拖尾因子和峰寬均降低，但色譜峰仍具有過載的特征 (Fig.3C) ；如緩沖液濃度增加 4倍并以乙腈代替甲醇，同時適當(dāng)減少乙腈的濃 度，流動相的離子強度增加近 6 倍，但峰形卻未見顯著改善。上述實驗結(jié)果表 明，克林霉素在固定相上的過載不僅僅與流動相的離子強度有關(guān)。在低pH值的流動相中，反相色譜柱易于為質(zhì)子化的堿性化合物所過載；在色譜柱均過載的 情形下，采用低pH值(pH23)流動相所得的色譜峰形明顯不

28、同于采用高 pH值 (pH7)流動相所得的色譜峰形，后者的峰形更復(fù)雜，后者同時還具有明顯的指數(shù) 拖尾(exponential tailing)也即動力學(xué)拖尾(kinetic tailing)的特征，提示在高pH值時除疏水相互作用外，還存在離子交換的相互作用11;填料表面 在高pH值流動相中出現(xiàn)陽離子交換位點，相應(yīng)地增加了色譜柱的容量；流動相 中反離子的化合價較高時(如BP流動相中的H2PO2-4之于ChP流動相中的 H2PO-4),反離子可與一個以上的有機離子形成中性離子對復(fù)合物24，相應(yīng)地減少了吸附在固定相表面的克林霉素分子及其相互間的靜電排斥效應(yīng)，增加 色譜柱的飽和容量。此外，流動相中選用

29、不同的有機溶劑，有可能影響固定相 的構(gòu)象以及被測物在固定相表面的吸附和分配，導(dǎo)致不同的色譜峰形。由于在 含有乙腈或甲醇的流動相中，堿性化合物的pKa值通?？呻S著有機溶劑濃度的增加而逐漸降低30, 35，故克林霉素(pKa值為76 36)在BP流動相中只 有少量以質(zhì)子化的形式存在，因而吸附在固定相表面的離子化的克林霉素分子 極少，克林霉素分子相互間的靜電排斥效應(yīng)較小，這使得色譜柱的飽和容量較 高；克林霉素在ChP流動相中則全部是以質(zhì)子化的形式存在的，故吸附在固定 相表面的克林霉素分子均以離子化的形式存在，其相互間的靜電排斥效應(yīng)較 大，致使色譜柱的飽和容量相應(yīng)較低。磷酸鹽 (磷酸的pKa值為22，

30、71，12315c)在ChP流動相中主以H2PO-4的形式存在。流動相中緩沖鹽的種類不 同，則色譜柱的飽和容量、色譜峰形以及表觀柱效等均不相同 9， 10， 27； 流動相中選用不同種類的無機反離子，質(zhì)子化的堿性化合物峰的理論板數(shù)和拖 尾因子均顯著不同，在已測試的四種反離子中，使拖尾因子降低、表觀柱效增 加的趨勢如下：六氟磷酸根(PF-6) 高氯酸根(ClO-4) 四硼磷酸根(BF-4) H2PO-4：27。向ChP流動相的緩沖液中添加 01mol/L NaClO4，雖然流動相的 離子強度僅增加 3 倍，但克林霉素峰的拖尾因子顯著降低，表觀柱效和保留時 間亦顯著增加，唯克林霉素與緊鄰的未知雜質(zhì)

31、的分離度并未如預(yù)計地顯著增 加，提示高濃度的 ClO-4 在該流動相中可能作為對離子改變了色譜系統(tǒng)的選擇 性。Fig.3 (略)3.4青霉素GUSPP4d測定青霉素G鉀中青霉素G含量的RPHPL係統(tǒng)與 BP3d不同，USP的流動相為甲醇：10mmol/L磷酸二氫鉀溶液(40 : 60), BP 的流動相則為甲醇：pH35磷酸鹽緩沖液(80mmol/L磷酸二氫鉀3mmol/L磷 酸)(35 : 65)。 USP的進樣量是BP的進樣量的1/20 ,選用USP的流動相和進樣 量，青霉素G峰形比較對稱，增加進樣量則峰形具有過載的特征(Fig.4A)。另選用其他 C18柱(Kromasil C18、In

32、ertsil ODS3 和 TSK GEL 0DS100實驗，結(jié) 果也如此。改用BP的流動相，青霉素G峰形對稱且?guī)缀醪皇苓M樣量大小的影 響。如將USP的流動相中的磷酸二氫鉀濃度增至 50mmol/L，同時甲醇濃度增至 50%，則峰形顯著改善，但仍稍具過載特征 (Fig.4B) ；繼用磷酸調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀 溶液的pH值至35,則峰形進一步改善(Fig.4C) 。 USP流動相中的磷酸二氫鉀溶 液(pH43)非緩沖液，實為幾無緩沖容量的鹽溶液，易導(dǎo)致緩沖液過載7，如進樣量較大則難以控制青霉素 G在流動相中的解離即二次化學(xué)平衡，且流動相 的離子強度較低，故色譜峰形隨著進樣量的增加而顯著展寬 (Fig.

33、4A) 。將流動 相中磷酸二氫鉀的濃度增至50mmol/L，增加了流動相的緩沖容量和離子強度， 色譜峰形相應(yīng)改善(Fig.4B);進一步調(diào)節(jié)磷酸二氫鉀溶液的 pH值至35,則流 動相的緩沖容量顯著增加，且由于在含有乙腈的流動相中，化合物酸性基團的 pKa值隨著乙腈濃度的增加而逐漸增加29, 34，故青霉素G的羧基pKa值 為 27(/pdf/veterinary/penicillinGin.pdf)在流動相中的解離被抑制，相應(yīng)地減少了吸附在固定相表面的離子化的青霉素G分子及其相互間的靜電排斥效應(yīng)，使色譜柱的容量、表觀柱效以及青霉素G的保留時間均相應(yīng)增加，青霉素

34、G在色譜過程中呈現(xiàn)出類似于中性化合物的色譜行為和 色譜峰形(Fig.4C)。類似的例子還有頭抱噻吩：ChP2d測定噻吩鈉中頭抱噻 吩含量的RPHPL(系統(tǒng)與BP和USP3e，4e不同，ChP的流動相為乙 腈：165mmol/L乙酸溶液(pH28)(1 : 3)，離子強度僅為13mmol/L，進樣量較大 (05mg/ml，12mmol/L，10卩l(xiāng))，故頭抱噻吩峰具有典型的過載特征；BP和 USP的流動相為乙腈：乙醇：pH59乙酸鹽緩沖液(含260mmol/L乙酸鈉和15mmol/L 乙酸)(15 : 7 : 79)，離子強度高達 205mmol/L，雖進樣量更大(1mg/ml， 10卩l(xiāng))，但

35、頭抱噻吩的峰形較為對稱，表觀柱效亦較高(圖略)。頭抱西?。?BP和USP 3f，4f的流動相分別為水：乙腈：乙酸(81 : 19 ： 1)和水：乙腈：乙 酸(84 : 16 ： 1)，離子強度僅為18mmol/L，緩沖容量較低(84mmol/L)，進樣量 較大(BP: 1mg/ml，22mmol/L，20 卩 l ; USP 03mg/ml, 07mmol/L，10 卩 l)，頭 抱西丁峰具有典型的過載特征。頭抱米諾：日抗基37的含量測定用流動相為：175mmol/L乙酸溶液(pH28):甲醇：四氫呋喃(990 : 5 : 5)，離子強度僅為 18mmol/L，且乙酸溶液實為幾無緩沖容量的鹽溶

36、液(緩沖容量為84mmol/L)，進 樣量較大(5mg/ml, 106mmol/L, 5卩l(xiāng))，故頭抱米諾峰具有典型的過載特征。哌 拉西林：ChP2e的含量測定用流動相為含10mmol/L磷酸二氫鈉和2mmol/L 氫氧化四乙基銨的甲醇：水(4 : 6)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至55)，離子強度亦較 低，約為12mmol/L,哌拉西林峰具有典型的過載特征。萬古霉素：BP和USP3g, 4g的有關(guān)物質(zhì)檢查用流動相為14mmol/L磷酸三乙胺緩沖液(pH32):乙 腈：四氫呋喃(92 : 7 : 1)，離子強度低至14mmol/L，萬古霉素B峰亦具有過載 的特征。作者：劉浩 王紅武 丁建英 仇仕林 【關(guān)

37、鍵詞】 ,RP 摘在反相高效液相色譜(RPHPLC過程中，流動相的離子強度可本篇論文是由3C0M文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站 的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否 者后果自負，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。Fig.4 (略)參考文獻1 Bogusz M. Journal Chromatography LibraryM . Amsterdam:Elsevier Publishing Company, 1995:Chapter 52 National Committee of Pharmacopoeia.Pharmacopoeia ofPe

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