現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用進(jìn)展

1、現(xiàn)代色譜技術(shù)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用進(jìn)展    【摘要】  本文闡述了高效液相色譜技術(shù)、高速逆流色譜技術(shù)、紅外光譜技術(shù)、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、色譜指紋圖譜、氣相色譜法、薄層層析及薄層掃描法、超臨界流體萃取-超臨界流體色譜法等八種技術(shù)在中藥復(fù)方中的最新應(yīng)用狀況，并且提出了較有價(jià)值的未來(lái)發(fā)展建議及規(guī)劃。 【關(guān)鍵詞】  色譜；中藥復(fù)方；應(yīng)用進(jìn)展     中藥是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，中藥復(fù)方提取物是一個(gè)較復(fù)雜的混合物。為提高中藥質(zhì)量，改變傳統(tǒng)中藥劑型“大、黑、粗”的狀態(tài)，讓中藥步入國(guó)際市場(chǎng)，一些現(xiàn)代高新工程技

2、術(shù)正被不斷地運(yùn)用到中藥生產(chǎn)中，使中藥生產(chǎn)不但更加符合傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論，也更加確保了中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量，還提高了現(xiàn)有中草藥資源的利用率。    中藥復(fù)方制劑現(xiàn)代化是目前我國(guó)醫(yī)藥科研人員和產(chǎn)業(yè)化所面臨的重大任務(wù)。中藥復(fù)方制劑現(xiàn)代化過(guò)程中一項(xiàng)很重要的任務(wù)就是利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)、計(jì)算機(jī)信息學(xué)等各項(xiàng)現(xiàn)代自然科學(xué)的最新方法和技術(shù)，從微觀分子水平認(rèn)識(shí)和發(fā)展中醫(yī)藥理論，研制出現(xiàn)代中藥復(fù)方新藥。論文學(xué)術(shù)科研網(wǎng)    隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，越來(lái)越多的高新技術(shù)將會(huì)運(yùn)用到中藥復(fù)方制劑有效成分的研究上。這些高新技術(shù)具有傳統(tǒng)方法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)提高中藥

3、制劑質(zhì)量、減少服用劑量、提高生產(chǎn)效率、降低環(huán)境污染等方面起到積極的推動(dòng)作用。本文對(duì)八種高新技術(shù)在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用進(jìn)展作了簡(jiǎn)要綜述。    1  高效液相色譜技術(shù)    1.1  中藥復(fù)方制劑質(zhì)量測(cè)檢方面的應(yīng)用1  中藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定勢(shì)在必行，但由于中藥復(fù)方制劑成分的復(fù)雜性，給這方面的工作造成很大困難。HPLC技術(shù)在這方面有很大優(yōu)勢(shì)，甘草復(fù)方制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)常以甘草酸作為指標(biāo)。用RP-HPLC以淺性回歸法測(cè)定甘草酸的結(jié)果表明其含量隨產(chǎn)地、藥材粗細(xì)、質(zhì)地、斷面顏色的不同而異，斷面越黃，質(zhì)地硬

4、脆，折斷性大者甘草酸含量高，為評(píng)價(jià)甘草復(fù)方制劑品質(zhì)提供了科學(xué)依據(jù)。    1.2  中藥配伍中的應(yīng)用1  中藥湯劑多為復(fù)方，每種生藥又含有多種化學(xué)成分。臨床共煎過(guò)程中可能產(chǎn)生揮發(fā)、分解、助溶、吸附、水解、取代、中和、沉淀等一系列十分復(fù)雜的化學(xué)物理變化，這些變化直接影響到制劑的療效和毒副作用。用反相高效液相色譜法測(cè)定川芎?jiǎn)渭鍎?，川芎、丹參合煎劑，川芎、?dāng)歸合煎劑及改味四物湯中阿魏酸的含量時(shí)發(fā)現(xiàn)各組湯劑中阿魏酸的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，配伍熟地對(duì)阿魏酸的溶出具有助溶作用。    2  高速逆流色譜技術(shù)2

5、0;   高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，簡(jiǎn)稱HSCCC）技術(shù)是一種不用任何固態(tài)載體或支撐體的液液分配色譜技術(shù)，分離效率高，產(chǎn)品純度高，不存在載體對(duì)樣品的吸附和沾染，具有制備量大和溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。至20世紀(jì)70年代末期，美國(guó)FDA和世界衛(wèi)生組織（WHO）開始利用此項(xiàng)技術(shù)作為分離抗生素成分進(jìn)行檢定。目前，已開發(fā)出生產(chǎn)型、分析型兩大類高速逆流色譜儀，分別用于中草藥復(fù)方制劑成分的分離制備和定量分析。進(jìn)樣量可從毫克級(jí)到克級(jí)，進(jìn)樣體積可從數(shù)毫升到幾百毫升，不僅適用于非極性化合物的分離也適用于極性化合物的分離，還可用于中

6、藥粗提取物中各組分的分離，也可用于進(jìn)一步精制。1994年HSCCC技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展，其進(jìn)樣量大大增加，能方便快速地分離克量級(jí)樣品，更有利于中藥復(fù)方制劑的分離制備。該技術(shù)有望成為中藥有效成分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究、分析的一種新方法，也將成為中藥生產(chǎn)的一種新型分離技術(shù)。    3  紅外光譜技術(shù)3    紅外光譜快速檢測(cè)中藥復(fù)方制劑時(shí)分三級(jí)鑒定，即對(duì)于差異較大的（如不同種類、不同炮制品等）中藥復(fù)方，僅需一般紅外光譜圖就可以做出判定，稱其為一級(jí)鑒定；差異性較小的（如不同產(chǎn)地、不同年限等）中藥復(fù)方可采用紅外光譜圖和二階導(dǎo)數(shù)譜圖相結(jié)合的方法對(duì)

7、其并作出判定，此稱為二級(jí)鑒定；當(dāng)紅外光譜圖和二階導(dǎo)數(shù)譜圖差異較小時(shí)，則可憑借二維相關(guān)紅外光譜加以判定，此為三級(jí)鑒定。這三級(jí)鑒定也是相互支持、相互佐證的，這樣下來(lái)可以基本鎖定中藥復(fù)方制劑的“全貌”便于鑒定其真?zhèn)?、?yōu)劣及炮制差異等。    樣品的無(wú)損處理指既不破壞單味中藥的整體性（四氣五味、升降沉浮、性味歸經(jīng)等的整體統(tǒng)一），又不破壞方劑配伍性（君臣佐使、相須相使等的整體統(tǒng)一）。在中藥復(fù)方制劑現(xiàn)代化的進(jìn)程中，利用紅外光譜技術(shù)快速、有效、易行可控、產(chǎn)業(yè)化程度高的檢測(cè)能力，可為生產(chǎn)過(guò)程的在線、現(xiàn)時(shí)檢測(cè)和藥檢部門建立快速質(zhì)檢反應(yīng)機(jī)制提供了新的手段，對(duì)企業(yè)生產(chǎn)的在線監(jiān)控和藥材市

8、場(chǎng)質(zhì)量監(jiān)控有重要意義。    4  色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)    4.1  色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用4  色譜和質(zhì)譜的聯(lián)用是目前最受重視的手段。應(yīng)用高效毛細(xì)管氣相色譜不僅能進(jìn)行上百個(gè)成分的分離，同時(shí)還能對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。目前，利用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)再加以匹配、識(shí)別和定性已很普遍，但色譜-質(zhì)譜聯(lián)用必須注意解決好來(lái)自于色譜和質(zhì)譜兩方面的問(wèn)題，主要包括液相色譜液體流動(dòng)相的去除，質(zhì)譜靈敏度、穩(wěn)定性的提高和質(zhì)譜體積、成本的降低。去除液相流動(dòng)相的最常用方法是將其揮發(fā)去除，因此當(dāng)液相色譜流動(dòng)相含水量較高、含有緩沖鹽和流速較高時(shí)，液相

9、色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的接口就變成技術(shù)的關(guān)鍵。目前，最廣泛使用的接口類型：最初電噴霧設(shè)計(jì)、加熱金屬毛細(xì)管、Turbo離子噴霧、Z型噴霧、正交噴霧、AQa等。    目前，將四極桿質(zhì)譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜組成串聯(lián)質(zhì)譜，結(jié)合最新發(fā)展的毛細(xì)管液相色譜技術(shù)組成的CapLC-Q-Tof-MS-MS，將集成高效毛細(xì)管液相色譜、四級(jí)質(zhì)譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前解決中藥復(fù)方制劑樣品分離分析的最尖端工具之一。學(xué)術(shù)科研網(wǎng)    4.2  大川芎方色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)實(shí)例4  大川芎方由川芎和天麻兩味藥組成，主要成分包括有機(jī)酸、生物堿、內(nèi)酯、揮

10、發(fā)油、苷類、多糖等。為了深入對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行研究，還需進(jìn)行其化學(xué)成分的系統(tǒng)分離分析研究。對(duì)于大川芎方中大量有效成分（阿魏酸、鹽酸川芎嗪、天麻苷等）還必須采用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行分析。對(duì)于大川芎的提取物，采用微柱液相色譜（2.1 mm內(nèi)徑柱）和大氣壓下電噴霧質(zhì)譜同時(shí)在正負(fù)離子模式下進(jìn)行了掃描分析，得到基峰色譜圖。從質(zhì)譜圖的分子離子峰和其與醋酸的加合離子峰可以判斷天麻苷峰和阿魏酸峰，進(jìn)一步用標(biāo)樣驗(yàn)證保留時(shí)間和質(zhì)譜圖均十分吻合。    5  色譜指紋圖譜5    中醫(yī)理論指導(dǎo)下的中藥，尤其是復(fù)方制劑，任何一種活性成分均不能反映中醫(yī)用

11、藥所體現(xiàn)的整體療效，這是中藥與化學(xué)合成藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的根本區(qū)別。所以宏觀地綜合分析成為必然的發(fā)展趨勢(shì)，綜合分析與整體分析成為分析化學(xué)發(fā)展的必然的反映。在尋求綜合評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的過(guò)程中，值得注意的趨勢(shì)是色譜指紋圖（chromatographic fingerprint）的應(yīng)用。    國(guó)外植物藥（復(fù)方制劑）色譜指紋圖譜的應(yīng)用：美國(guó)FDA允許草藥保健品申報(bào)資料可以提供色譜指紋圖鑒別資料6。此外，WHO在1996年草藥評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則中也有規(guī)定，如在“Plant preparations”及“Finished product”的章節(jié)中都提到“如果不可能鑒別有效成分，則鑒別1種或

12、幾種特征成分（如色譜指紋圖譜）以保證制劑和產(chǎn)品質(zhì)量的一致”7。歐共體在草藥質(zhì)量指南的注釋8中提到“草藥的質(zhì)量穩(wěn)定性單靠測(cè)定已知的有效成分是不夠的，因?yàn)椴菟幖捌渲苿┦且云湔w作為有效物質(zhì)。因此，應(yīng)該通過(guò)色譜指紋圖譜顯示其所含的各種成分在草藥及其制劑中是穩(wěn)定的，其含量比例能保持恒定。例如歐山楂（花葉）的薄層色譜指紋圖譜所顯示的結(jié)果?！?#160;   中藥色譜指紋圖譜（圖像）的實(shí)驗(yàn)研究難度較大是不言而喻的，涉及的技術(shù)問(wèn)題較多，需要通過(guò)更多的實(shí)踐和共同努力逐步解決。    6  氣相色譜法（GC）6    GC

13、是一種較為傳統(tǒng)的色譜方法，具有高柱效、高選擇性、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用廣等優(yōu)點(diǎn)。在中藥研究方面GC最大的弱點(diǎn)在于其受樣品蒸汽壓的限制，對(duì)于揮發(fā)性小的或熱不穩(wěn)定成分需采用衍生化法或裂解法以增加其揮發(fā)性，但也由此增加了操作的復(fù)雜性。在中藥研究方面GC主要用于揮發(fā)性成分的研究，如：蒎烯、龍腦、芳樟醇、檸檬烯等，涉及的中藥分屬唇形科、傘形科、姜科、五加科、菊科等，如干姜、淫羊藿、西洋參、砂仁等；GC亦可用于中藥中的其他成分的研究及測(cè)定，例如：對(duì)獨(dú)角蓮、哈士膜卵油的分析。因此，可以看出GC在中藥復(fù)方研究中的應(yīng)用尚有開發(fā)空間。    7  薄層層析（TLC）及薄

14、層掃描法（TLCS）6    薄層層析及薄層掃描法是較早應(yīng)用于中藥分析的一種色譜法，由于其操作簡(jiǎn)便、色譜結(jié)果直觀、顯色方式可選性大，兼具分離鑒定雙重功能且所涉及的設(shè)備價(jià)格較為低廉，故應(yīng)用廣泛。對(duì)于成分復(fù)雜不明，或含無(wú)揮發(fā)性、低UV吸收成分的中藥，TLC及TLCS有其應(yīng)用前景。例如對(duì)川芎等藥材，應(yīng)用TLCS可測(cè)定銀杏葉制劑中萜類內(nèi)酯之含量9。但TLC和TLCS因其色譜結(jié)果易受鋪板、點(diǎn)樣溫濕度影響，有時(shí)難以重復(fù)；顯色又受顯色的均勻性、靈敏度等因素影響，因此，其測(cè)定結(jié)果偏差較大。    8  超臨界流體萃取-超臨界流體色譜法（SFE-SFC）6    SFE-SFC具