熒光與亞甲藍聯用對血漿中病毒滅活的研究

1、    熒光與亞甲藍聯用對血漿中病毒滅活的研究黃宇聞程慶文莫琴謝如鋒錢開誠 提要以細胞感染試驗、凝血法、交叉免疫電泳等技術，觀察熒光與亞甲藍聯用對血漿中水泡性口炎病毒（VSV）和辛德比斯病毒（SV）的滅活效果及血漿蛋白的變化。結果，向盛裝在聚氯乙烯袋內的血漿中加1 mol/L亞甲藍并經熒光(30 000 Lux)照射30 min，可將血漿中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV滅活。消毒后，血漿中的:C、:C、纖維蛋白原的回收率>75，白蛋白、球蛋白的回收率>85，蛋白免疫原性無變化。 關鍵詞協同滅活病毒作用熒光亞甲藍血漿消毒水泡

2、性口炎病毒辛德比斯病毒 STUDY ON INACTIVATION OF VIRUS IN PLASMA BY COMBINATION OF FLUORESCENCE AND METHYLENE BLUE Huang YuwenCheng QingwenMo QinXie RufengQian Kaicheng (Shanghai Blood Center, Shanghai 200051) AbstractTechniques such as cell infection test, blood coagulation method and crossed immunoelectrophor

3、esis were used to observed the efficacy of combination of fluorescence and methylene blue in inactivating vesicular stomatitis virus (VSV) and Sindbis Virus in plasma and the changes in plasma protein. The results showed that addition of 1 mol/L methylene blue to the plasma in polyvinyl chloride bag

4、 which was also exposed to fluorescence (30000 Lux) irradiation for 30 min could inactivate VSV and SV with titers >7 TCID50 (lg) in plasma. After disinfection, the recovery rates of F:C， F:C and fibrinogen were >75% and the recovery rates of albumin, globulin (IgG, IgA, IgM) were >85%, whi

5、le no change in protein immunogenicity was observed. Key wordssynergetic inactivating effect on virusfluorescencemethylene blueplasma disinfectionvesicular stomatitis virusSindbis virus 為防輸注血漿引起感染乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等的危險，已研究出多種對血漿中病毒滅活的方法，如加熱法、有機溶劑加表面活性劑（S/D）法、乙型丙內酯加長波紫外線法等1。對臨床用單袋血漿中病毒的滅活，上述方法均不適宜，而

6、宜采用亞甲藍加可見光照射法2。我們將染以指標病毒的血漿盛裝于聚氯乙烯（PVC）袋內，向血漿中加亞甲藍后經不同光源照射，觀察病毒滅活效果及其對血漿蛋白質的影響。發(fā)現以熒光光源照射者對病毒滅活效果較好，血漿內各種蛋白損失較小。為此，對亞甲藍加熒光照射法進行了較詳細地研究?，F將結果報道于下。 1 方法 1.1 試驗病毒 試驗用水泡性口炎病毒（VSV，Indiana株）和辛德比斯病毒（SV，與VSV均由中國藥品衛(wèi)生制品鑒定所提供），分別以非洲綠猴腎細胞（Vero）、BHK細胞為宿主傳3代。收集上清液，測得病毒滴度>7 lgTCID50/ml，分裝于無菌塑料試管中，置- 80保存，備用。 1.2

7、含病毒血漿的制備及滅活試驗 隨機取采血后6 h內分離冰凍的ACD (acid-citrate-dextrose)抗凝血漿（盛裝于PVC塑料袋內，100 ml/袋），于37融化后，按血漿病毒液91的容量比接種病毒，混勻。 試驗時，取該血漿1 ml作為消毒前對照，取該血漿99 ml加入100 mol/L的注射用亞甲藍1 ml（血漿中亞甲藍濃度為1 mol/L），隨即用熒光（30 000 Lux）照射30 min。 1.3 病毒的滴定 病毒滴定均按終點稀釋法，在96孔板上進行。樣本經10倍梯度稀釋，每一稀釋度接種46孔。同時設有細胞對照，并盲傳三代。據細胞病變效應（CPE），按Karber公式計算T

8、CID50。 lg TCID50=l-d(s-0.5) 式中，l為病毒最高稀釋度的對數，d為稀釋度對數間差數，s為病變細胞比例總和。 1.4 血漿蛋白的測定 F:C及F:C活性的測定按一期法3進行，纖維蛋白原含量測定采用凝血法。蛋白質含量（包括白蛋白和球蛋白）用比濁法測定。以交叉免疫電泳法測定消毒前后血漿蛋白質免疫原性變化。 1.5 動物安全試驗 取約3 kg體重健康家兔6只。試驗前，置于固定器中停止給食2 h。然后，從耳靜脈抽血（抽血量為6.5 ml/kg體重）。分離血漿，加入亞甲藍至試驗濃度并經熒光照射30 min后，-20凍存。一周后，將該血漿對家兔作自身回輸，觀察體重與體癥狀況。 2

9、結果 2.1 滅活病毒效果 在血漿中加1 mol/L亞甲藍經熒光（30 000 Lux）照射30 min，可使血漿中滴度>7 TCID50(lg)的VSV和SV達到滅活（表1）。單對血漿中VSV，只要加0.10 mol/L亞甲藍經熒光照射30 min，即可滅活（表2）。細胞對照盲傳3代均未見崐特異CPE。 表1 亞甲藍加熒光照射對血漿中病毒的滅活效果 Table 1 Efficacy of methylene blue plus fluo- rescence irradiation in inactivating virus in plasma 處理時間 VSV滴度 SV滴度 Expos

10、ure VSV SV time titer titer (min) (lg,TCID50) (lg,TCID50) 15 < 0.50* 1.09 30 < 0.50 < 0.50 >>> 注:* 表示所用方法已測不到病毒滴度。對照病毒滴度VSV為7.5 TCID50(lg)，SV為7.28 TCID50(lg)。血漿中亞甲藍濃度為1 mol/L。Note: * means that the virus titer was not detected by the method used. The titer of control virus was 7.5

11、TCID50 (lg) for VSV and 7.28 TCID50 (lg) for SV. The concentration of methylene blue in plasma was 1 mol/L. 表2 不同濃度亞甲藍加熒光照射對血漿中VSV的 滅活效果 Table 2 Efficacy of methylene blue at different con- centrations plus fluorescence irradiation in inactivating VSV in plasma 亞甲藍濃度 Concentra- tion of methylene blu

12、e (molL) 照射不同時間(min)的 VSV滴度 (lg, TCID50) VSV titer (lg, TCID50) after irradiation for different periods of time (min) 15 30 0.80 < 0.50* < 0.50 0.40 < 0.50 < 0.50 0.20 < 0.50 < 0.50 0.15 2.50 < 0.50 0.10 2.50 < 0.50 注:*表示所用方法已測不到病毒滴度。對照病毒滴度為7.5 TCID50(lg)。Note: * means that t

13、he virus titer was not detected by the method used. The titer of control virus was 7.5 TCID50 (lg). 2.2 對部分凝血因子活性的影響 加1 mol/L亞甲藍后經熒光（30 000 Lux）照射30 min，血漿中F :C及F:C、纖維蛋白原（Fir）的回收率均仍達75以上（圖1）。 圖1 亞甲藍加熒光照射對部分凝血因子的影響 Fig 1 Influence of methylene blue plus fluorescence irradiation on some coagulation fa

14、ctors - F :C，-F :C，-Fir (fibrinogen) 2.3 對蛋白質含量及其免疫原性的影響 加1 mol/L亞甲藍后經熒光（30 000 Lux）照射30 min, 血漿白蛋白、球蛋白的回收率均仍高于85（表3）。 表3 亞甲藍加熒光照射對血漿蛋白質含量的影響 Table 3 Influence of methylene blue plus fluores- cence irradiation on plasma protein content 蛋白質Protein Recovery rate (%) after 作用30 min后的回收率(%) exposure for

15、 30 min 白蛋白 Albumin 93.13±9.20 IgG 87.79±10.54 IgA 89.99±9.46 IgM 86.95±10.37 注:血漿中亞甲藍濃度為1 mol/L。熒光照射前白蛋白、球蛋白回收率均為100。數據為檢測10份樣本的結果。Note: Methylene blue concentration in plasma was 1 mol/L. Recovery rate of albumin and globulin before fluorescence irradiation was 100%. The result

16、s are means of 10 samples.于消毒前后以交叉免疫電泳法測血漿蛋白免疫原性沒有變化，各沉淀線位置一致（圖2）。 2.4 動物試驗結果 試驗表明，將加濃度為1 mol/L或10 mol/L亞甲藍并經熒光（30 000 Lux）照射30 min的兔血漿，回輸給原采血兔。7天內，該兔體重變化和毛色均與對照組兔子一致。 3 討論 3.1 據報道，亞甲藍加可見光照射可以滅活大多數有脂質包膜的RNA和DNA病毒。亞甲藍與病毒核酸的鳥嘌呤結合，在可見光的作用下，使病毒核酸斷裂，阻止其復制。此外，在有氧條件下還可產生氧自由基，對脂質包膜病毒的膜蛋白和核酸鏈也有破壞作用2,4。滅活病毒的效

17、果與亞甲藍濃度和光照強 度有關4。我們以亞甲藍加熒光照射亦能滅活血漿中VSV和SV，滅活所需時間隨血漿中亞甲藍濃度升高而縮短。 圖2 亞甲藍加熒光消毒前后的血漿蛋白免疫性 Fig 2 Plasma protein immunogenicity before and after disinfection by methylene blue plus fluorescence irradiation 3.2 在新鮮冰凍血漿所含的諸成分中，以不穩(wěn)定的凝血因子對理化作用較為敏感。研究者多以:C、:C及纖維蛋白原的回收率作為衡量理化作用對血漿有效成分影響的指標5,6。本試驗表明，經1 mol/L亞甲藍加

18、熒光（30 000 Lux）照射30 min后，血漿纖維蛋白原、:C和:C等凝血因子回收率均>75，即無明顯不良影響。同時，血漿中主要蛋白質，如白蛋白、球蛋白（IgG、IgA、IgM）回收率亦均在85以上；血漿蛋白質免疫原性亦沒有變化。亞甲藍作為治療用藥，臨床較低劑量為266 mol/50 kg。本研究所用量（1 mol/L）以2 L/50 kg體重輸注計，輸注量尚不足其1，故是安全的。將兔子血漿用亞甲藍加熒光照射后回輸，亦表明對動物無毒副作用。 本課題研究過程中承蒙上海市血液中心張欽輝教授、高峰教授的指導，并得到上海市血液中心鑒定室動物房陳桂珍老師的幫助，特此致謝。 黃宇聞（上海市血液中心，上海200051） 程慶文（上海市血液中心，上海200051） 莫琴（上海市血液中心，上海200051） 謝如鋒（上海市血液中心，上海200051） 錢開誠（上海市血液中心，上海200051） 參考文獻 1Ben-Hur E, Horowitz B. Virus inactivation in blood. AIDS, 1996; 10:1183. 2Lambreoht B, Mohr H, Knuver-Hopf J, et al. Photoinactivation of viruses in human fresh plasma