紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結構和細胞凋亡及bcl

1、KKME-專業(yè)醫(yī)學搜索引擎紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結構和細胞凋亡及bcl2、bax蛋白表達的影響作者：徐傳金 張文忠 馮培青 蔡尚郎 作者單位：青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內科，山東 青島 266003 【摘要】目的 通過在體兔心肌缺血再灌注模型，研究紅花黃色素對家兔缺血再灌注心肌超微結構和細胞凋亡及bcl2、bax蛋白表達的影響。方法 24只新西蘭大白兔隨機分為3組：缺血再灌注組(IR組)，紅花黃色素組(SY組)，藥物組(MI組)，每組8只。實驗終末，取缺血壞死區(qū)心肌在光鏡、電鏡下觀察心肌細胞凋亡狀況，并且檢測bax和bcl2蛋白在心肌細胞中的表達水平。結果 與IR組相比，SY組能減輕

2、缺血心肌超微結構的改變，并通過上調bcl2、下調bax表達抑制細胞凋亡。結論 紅花黃色素能產生心肌保護作用，RISK信號轉導通路可能參與了這一過程。 【關鍵詞】 紅花黃色素;缺血再灌注;細胞凋亡;bcl2;bax 紅花黃色素(safflower yellow,SY)是從紅花中提取的有效成分1，2，是臨床常用的活血化瘀藥物?，F代藥理研究表明，紅花水煎劑能抑制血小板聚集，降低血液黏稠度3，其有效成分SY能延長凝血酶原時間和凝血酶時間4。SY具有提高心肌和血漿中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，加速自由基的清除等作用5。本實驗通過觀察SY對家兔缺血再灌注心肌超微結構和凋亡及相關基因表達的影響，驗證其對

3、心肌缺血的保護作用，并探討其可能的機制。 1 材料與方法 1.1 實驗動物和分組 健康新西蘭大白兔24只(購自河南醫(yī)科大學動物中心)，雌雄不分，體重2.02.5 kg，隨機分為3組，每組8只。缺血再灌注組(IR組)：結扎左冠狀動脈前降支1 h,再灌注6 h。SY組：于再灌注前10 min耳緣靜脈注射SY 10 mg/kg，余同IR組。藥物組(MI組)：于再灌注前5 min耳緣靜脈注射磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002(0.3 mg/kg)，余同SY組。 1.2 方法 采用烏拉坦(1 g/kg)耳緣靜脈注射麻醉。仰臥位固定，心電圖導線與兔四肢相連，記錄12導聯(lián)心電圖，連接心電監(jiān)護

4、。除毛，沿胸骨正中偏左0.5 cm切開皮膚，暴露左側3、4肋骨，鈍性分離肋間肌，小彎鉗于肋下穿10號縫合線2根，分別結扎，沿結扎線正中剪斷3、4根肋軟骨;牽拉兩側結扎線，暴露胸腔，分離脂肪組織，可見心包及搏動之心臟。提起心包膜正中，用眼科剪將心包膜前部剪開,將心包膜用縫線固定于胸壁，充分暴露心臟。用止血鉗將左心耳輕輕提起，觀察冠脈的走行。以左冠狀動脈主干為標志，在左心耳根部下方2 mm處，用持針器持小圓針在冠狀動脈前降支根部穿一結扎線，結扎線穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁穿出;在該結扎線下方約0.5 cm處再穿一結扎線，雙重結扎左前降支1 h，再灌注6 h。心電圖胸前導聯(lián)出現ST段弓背向上抬高為

5、結扎成功。 各組動物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織行蘇木素伊紅(HE)染色，觀察心肌細胞形態(tài)學改變。實驗步驟如下：取材固定脫水和透明透蠟包埋切片及貼附脫蠟復水染色水洗分化漂洗復染透明封藏，切片經中性樹膠封藏，等樹膠干后就可在鏡下進行觀察。 各組動物于再灌注末取缺血壞死區(qū)心肌組織進行超薄切片觀察心肌細胞超微結構改變。實驗步驟如下：取材：取缺血再灌注區(qū)組織，制成1 mm3的組織塊;2.5%戊二醛4固定4 h;磷酸緩沖液(PBS)漂洗3次;1%鋨酸固定3 h;PBS漂洗3次;脫水;浸透：用二甲基酮與Epon812包埋劑混合液(12)浸透;包埋：將樣品移到Epon812包埋劑中進行包埋;超薄切片：用U

6、ltracutE超薄切片機進行超薄切片，厚度為50100 nm，干燥后即可染色;染色：醋酸雙氧鈾染色15 min，蒸餾水徹底水洗3次;枸櫞酸鉛染色15 min，再用蒸餾水徹底水洗3次。切片干燥后即可置于電子顯微鏡(日本JEOL公司JEM1200EX透射電鏡)下觀察。 嚴格按照試劑盒說明書操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。每張切片隨機選擇5個視野(×400)，記錄陽性染色的心肌細胞數及心肌細胞總數，以凋亡細胞數占心肌細胞總數的百分比來確定凋亡指數(AI)。AI=Tunel陽性細胞數/心肌細胞總數×100%。2、bax蛋白表達的免疫組化(SP)法檢測 將取材中

7、10%中性甲醛固定的標本固定24 h后行常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度約4.5 m，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上。二甲苯和酒精脫蠟;3%過氧化氫孵育10 min以消除內源性過氧化物酶活性，PBS液沖洗;5%10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min;加入一抗：bcl2、bax均為1100稀釋后加入玻片中，4過夜，PBS液洗3次，每次5 min;加入二抗：滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗，37孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。顯色：加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑510 min;HE復染2 min，脫水、透明、封片、鏡檢。每張切片隨機選取5個視野(×400)采用VIDAS圖

8、像分析系統(tǒng)(德國歐波同公司)測定其陽性表達面積、平均光密度和積分光密度，并采用公式：單位面積平均光密度=積分光密度/(512×512)×100% 進行數據換算。 1.3 統(tǒng)計學處理 實驗數據均以x±s表示,使用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行分析,組內比較采用方差分析，兩組間比較采用q檢驗(Student NewmanKeuls法)。 2 結 果 2.1 光鏡學觀察 IR組心肌細胞間質水腫，細胞界限不清，可見較多粒細胞灶狀浸潤，并可見少量紅細胞滲漏。SY組心肌細胞輕度水腫，界限清楚，心肌細胞排列相對規(guī)則，見少量粒細胞浸潤，無紅細胞滲漏。MI組心肌細胞水腫嚴重，部分細

9、胞溶解，細胞界限欠清楚，橫紋消失，可見較多粒細胞浸潤，并可見紅細胞滲漏。 2.2 電鏡下觀察 IR組心肌細胞水腫明顯;線粒體明顯腫脹，溢出到細胞外，嵴明顯減少，基質中致密顆粒減少甚至消失，伴空泡樣形成;肌膜破壞，出現膜斷裂、缺損，肌原纖維模糊，部分Z線不明顯;細胞核腫脹，異染色質增多，核不規(guī)則，甚至核碎裂。SY組超微結構變化輕微，僅見心肌細胞內輕度水腫;線粒體輕度腫脹，嵴部分消失;肌原纖維排列規(guī)則，肌小節(jié)清楚，僅見少量肌絲斷裂，Z線明顯，閏盤清晰;細胞核內物質分布均勻，無核裂解及固縮現象。MI組細胞水腫明顯，胞膜固縮消失;線粒體彌漫性腫脹，;糖原減少，肌原纖維極度松弛、拉長，Z線扭曲、變形，肌

10、絲橫斷、撕裂、溶解;核固縮，可見凋亡小體;間質明顯水腫。 2.3 凋亡細胞Tunel檢測結果 IR組AI為21.37±3.86，SY組AI明顯降低(15.47±3.63)(P<0.01)，而MI組AI(23.38±3.77)與IR組接近(P>0.05)。 2.4 心肌細胞中bcl2、bax蛋白的表達 bcl2陽性細胞表現為胞漿及胞膜呈棕褐色，bax陽性細胞表現為胞漿呈棕褐色。著深棕色者為強陽性表達細胞，不著色者為陰性表達細胞，介于兩者之間者為弱陽性表達細胞。各組心肌細胞bcl2、bax蛋白表達見表1。表1 各組心肌細胞AI、bcl2、bax蛋白表達(略

11、) 3 討 論 心肌細胞超微結構的改變是反映細胞損傷最直觀的指標,心肌缺血3040 min，心肌細胞可發(fā)生缺血性損害。光鏡下觀察見正常心肌細胞內中性粒細胞及紅細胞浸潤等損傷。線粒體對缺血缺氧十分敏感,是決定細胞由可逆到不可逆改變的關鍵細胞器，線粒體彌漫性腫脹，膜破裂、嵴溶解、消失，基質出現嗜鋨性顆粒等均是缺血造成的損傷。本研究發(fā)現,SY可以減輕心肌細胞超微結構的變化,從而對心肌產生保護作用。 細胞凋亡是機體的正常細胞在受到生理性或病理性刺激后啟動的自發(fā)死亡過程是缺血再灌注損傷發(fā)病機制中的一個重要環(huán)節(jié)6。大多數細胞在凋亡過程中需要新基因的表達和蛋白質的合成。bcl2基因是凋亡抑制基因，其過量表達

12、可阻斷因缺血、細胞因子短缺、輻射、抗腫瘤藥物、cmyc等不同刺激誘發(fā)的細胞凋亡。bcl2抑制凋亡的機制是它可直接或間接地阻止細胞色素C自線粒體的釋出，而后者可與ATP一起改變Apaf1的構型而使caspase9激活。bax基因為促進凋亡基因，主要表達于線粒體膜和內質網膜上。bax與bcl2有很高的同源性，能與bcl2形成異源二聚體，通過抑制后者的活性，使凋亡易于發(fā)生。bcl2和bax的表達程度決定了細胞命運，bcl2占優(yōu)勢時阻止細胞凋亡發(fā)生，而Bax占優(yōu)勢時細胞趨向凋亡7。本研究采用Tunel法、SP技術檢測了心肌細胞AI及bcl2、bax蛋白的表達，結果顯示各組均有一定的心肌細胞凋亡，而SY

13、組AI明顯較低，證實了SY可以減輕缺血再灌注損傷后的心肌細胞凋亡程度;同時發(fā)現SY組bcl2蛋白表達增強，而bax蛋白表達明顯減少，進一步顯示，SY對缺血再灌注心肌凋亡相關基因的表達具有顯著的作用，即明顯上調bcl2的表達、下調bax的表達，從而發(fā)揮對心肌的靶保護作用。 目前認為缺血預處理的機制是短暫的缺血再灌注使大量的內源性物質如腺苷、緩激肽、阿片等釋放7，然后作用于相應的受體，誘導蛋白激酶C(PKC)的激活，再進一步激活其他激酶，最終激活再灌注損傷補救酶(RISK)途徑，使效應器磷酸化，效應器可能主要是線粒體上的ATP敏感性鉀通道(mKATP)，誘導心肌保護機制8。PI3K是RISK信號轉

14、導通路的組成之一9。本研究通過應用藥物PI3K抑制劑LY294002發(fā)現，該藥物能夠阻斷SY對心臟的保護作用，因此推測RISK參與了SY對心肌的保護作用,其具體機制尚待進一步研究。 【參考文獻】 1 李中原，涂秀華.紅花黃色素的藥理研究進展J.中藥新藥與臨床藥理，2005;16(2)：1536. 2 李 芳，孫明智.紅花黃色素對豚鼠心室乳頭肌缺氧和復氧損傷的保護作用J.哈爾濱醫(yī)科大學學報，1999;33(1)：68. 3 顧紅璋.中藥紅花煎劑對血小板聚集功能的影響J.中國血液流變學雜志,1994;2:48. 4 黃正良，崔程梅，任 遠.紅花黃色素的抗凝血作用研究J.中成藥,1987;18(4)

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