羅丹明熒光探針在生化分析中的應(yīng)用

1、http:化學(xué)通報(bào)2009年第1期15羅丹明熒光探針在生化分析中的應(yīng)用高勇張敏郭斌112(1福建師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院福州350007;2南京林業(yè)大學(xué)信息學(xué)院化學(xué)與材料系南京210037)摘要羅丹明熒光探針作為生物學(xué)研究中使用最廣泛的熒光探針之一,廣泛地應(yīng)用于活體細(xì)胞內(nèi)小分子的檢驗(yàn)、生物大分子的分析以及復(fù)雜生物體系的研究等方面。融合了分子生物學(xué)、分析化學(xué)、有機(jī)化學(xué)等多個(gè)學(xué)科,光探針在生化分析中的應(yīng)用進(jìn)展,關(guān)鍵詞羅丹明熒光探針生化分析ProbesinBiochemicalAnalysisGaoYong,ZhangMin,GuoBin2112(1CollegeofChemi

2、stryandMaterialsScience,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007;CollegeofInformationScienceandTechnology,NanjingForestryUniversity,Nanjing210037)AbstractRhodaminefluorescentprobeisoneofthemostusedfluorescentprobesinbiologicalresearch.Itiswidelyusedinresearchesofsmallmoleculesassaywithinlivecells,biologi

3、calmoleculesdetectionandcomplexbiologicalsystems.Thestudyofrhodaminefluorescentprobeinbiochemicalanalysisisacross2disciplinecombiningbiology,analyticalchemistryandorganicsynthesis,itisasignificantdirectioninthedevelopmentofcurrentchemistrywithabrightprospect.Theprogressinthefieldisreviewedinthispape

4、r.Thedevelopingtrendsofthefieldarealsodiscussed.KeywordsRhodamine,Fluorescentprobe,Biochemicalanalysis羅丹明類化合物具有摩爾吸收系數(shù)高、熒光量子產(chǎn)率高和激發(fā)波長長的特點(diǎn),能滿足使用綠激光器的激光誘導(dǎo)熒光系統(tǒng)發(fā)展的需要,在液相色譜和毛細(xì)管電泳分離及熒光檢測時(shí)背景信號干擾也較少。通過對母體結(jié)構(gòu)的修飾,可以調(diào)控羅丹明類化合物的最大吸收波長、最大發(fā)射波長、量子產(chǎn)率等熒光特性,從而很好地滿足不同的使用要求1。另外,羅丹明類化合物適用的pH范圍寬,可在低于生物體的pH的條件下使用。因此,以羅丹明為熒光發(fā)色

5、團(tuán)的羅丹明熒光探針已被廣泛應(yīng)用于生物體內(nèi)離子及小分子的檢測、生物大分子的分析和檢測以及復(fù)雜生物體系的研究等領(lǐng)域。近年來,羅丹明熒光探針的研究取得了大量新成果,國內(nèi)介紹其合成及應(yīng)用的文章也不斷出現(xiàn)27。本文就羅丹明熒光探針在生化分析中的應(yīng)用研究進(jìn)展做一介紹。1生物體內(nèi)離子及小分子的檢測羅丹明作為古老的熒光化合物被廣泛地應(yīng)用于各類小分子及離子的檢測8。目前基于羅丹明熒光特性的離子及小分子的分析方法,正在朝著高選擇性、高靈敏度、生物活體內(nèi)檢測的方向不斷發(fā)展。92+2+2005年,Yang等利用Hg與羅丹明衍生物的反應(yīng)建立了一種水相中快速分析Hg的方法(圖式1)。通過Hg對化合物1(無熒光)的誘導(dǎo)開環(huán)

6、-環(huán)化使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛衔?(強(qiáng)熒光),該方法有很好的選擇性和靈敏度。2007年,Wu等2+102+利用同樣的原理,設(shè)計(jì)合成了化合物1的類似物,用于Hg的水相分析,將含二茂鐵的基團(tuán)引入羅丹明B,得到的熒光探針生物親和性良好,2+也取得了良好的效果。Yang等11可以用于活細(xì)胞內(nèi)Hg的檢測。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞物質(zhì),起著調(diào)節(jié)許多重要細(xì)胞功能如肌肉收縮、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)以及細(xì)胞分福建省教育廳科技項(xiàng)目(JB06070)資助2008203211收稿,2008206211接受16化學(xué)通報(bào)2009年第1期http:圖式1Hg2+誘導(dǎo)開環(huán)-環(huán)化機(jī)理9Scheme1Hg2+Inducedri

7、ngopeningandcyclization9化和增殖等的作用。作為第二信使,鈣離子參與生物信號的跨膜傳遞、維持神經(jīng)和肌肉的正常興奮性以及介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)等。因此如何準(zhǔn)確、快速地測量活細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度及其變化在12,13生命科學(xué)的研究中顯得十分重要。近年來,以羅丹明為母體的鈣離子熒光探針給測量和分析細(xì)胞14,15內(nèi)鈣離子濃度及其變化提供了一種新手段。該類鈣離子熒光探針通常由羅丹明熒光發(fā)色團(tuán)和1,22二(22氨基苯氧基)乙烷2N,N,N,N2四乙酸(BAPTA)片段兩部分組成(圖式2)。BAPTA片段在與鈣離子螯合時(shí)發(fā)生的構(gòu)象變化,會引起探針分子熒光強(qiáng)度的增減或最大發(fā)射波長的改變

8、,通過檢測熒光信號變化即可方便的測量活體細(xì)胞的鈣離子濃度。圖式2羅丹明基鈣離子熒光探針Scheme2CalciumconcentrationfluorescenceprobebasedonrhodamineKojima等16,17報(bào)道了一類基于羅丹明發(fā)色團(tuán)的熒光探針,可用于生物活體內(nèi)NO的分析,該方法很18好解決了以往的熒光探針對pH敏感和受生物體自身熒光干擾的問題。此外,羅丹明熒光探針還可以對生物體系中的硫醇類化合物、次氯酸19、Cu2+20,21等進(jìn)行檢測。2酶、多肽、蛋白的分析和檢測對酶、多肽、蛋白的分析和檢測是生命科學(xué)的重要研究內(nèi)容和基礎(chǔ)。羅丹明熒光探針在這一領(lǐng)域發(fā)揮了重要的作用。在酶

9、分析方面,一個(gè)典型的例子就是對半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶(Caspase)的分析和檢測。Caspase是一組具有相似的氨基酸序列、二級結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶,與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān),還參與http:化學(xué)通報(bào)2009年第1期17細(xì)胞因子的成熟、細(xì)胞生長和分化。通過對Caspase的結(jié)構(gòu)、特性及生理作用的不斷研究,有助于認(rèn)識其22在細(xì)胞凋亡中的作用,為腫瘤和許多慢性疾病的防治和藥物開發(fā)提供更多選擇。研究人員以羅丹明為母體設(shè)計(jì)合成了大量的熒光探針,實(shí)現(xiàn)了對Caspase尤其是Caspase23的細(xì)胞活體檢測、分析和顯2325影,為相關(guān)生命科學(xué)研究提供了有力的工具。羅丹明熒光探針在

10、多肽和蛋白的分析、檢測方面也有著廣泛的應(yīng)用。谷胱甘肽是維持人體細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵性物質(zhì),其濃度變化的數(shù)據(jù)有重要的病理學(xué)價(jià)值。Pires等設(shè)計(jì)合成的含有二硫鍵27的羅丹明熒光探針可以檢測活體細(xì)胞中谷胱甘肽的濃度。Julien等的研究證明,通過測量特定雙官能團(tuán)羅丹明探針的熒光偏振數(shù)據(jù),例如,可以確定蛋白質(zhì)在肌肉纖維中的排列走向。目前,已經(jīng)突破了傳統(tǒng)的對單一化合物定性定量分析的范圍,(微觀影2829響)的方向發(fā)展。Houghten;Mercier等利用NMR。這些研究方向是生命科學(xué)與化學(xué)的深層次交26叉,。3遺傳物質(zhì)的分析和測定羅丹明熒光探針在基因分析和DNA測序中已有廣泛的應(yīng)用。由于該類技術(shù)具

11、有廣闊的應(yīng)用32,33前景和巨大的商業(yè)價(jià)值,相關(guān)的專利報(bào)道也較多。另外,利用羅丹明與DNA分子的弱相互作用,也34,35可以對DNA分子進(jìn)行定量測定。肽核酸(PNA)是一類以多肽為骨架的核苷酸類似物,它不帶電荷,雜交特異性強(qiáng),能抵抗核酸酶及蛋白酶的降解,因此可作為雜交探針用于疾病診斷,或作為反義試劑進(jìn)行基因治療的探索。利用羅丹明熒光探針可以對PNA的雜交特異性、生物親和性等方面進(jìn)行研究36,3730,31。4研究分子間的相互作用或生化反應(yīng)利用熒光受體與熒光給體之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)構(gòu)建的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針是研究38生物大分子間,甚至生物大分子內(nèi)部的不同部位間的相互作用的有力工具。

12、考慮到熒光受體與熒光給體的熒光光譜之間要有一定程度的重疊才可能發(fā)生FRET,所以羅丹明一般作為受體與作為給體的熒39,40光素組成熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。當(dāng)然羅丹明也可以與其他符合熒光光譜條件的生物活性物質(zhì)組41成熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。例如,Tahtaoui等用羅丹明為熒光受體、哌侖西平(Pirenzepine)為熒光給體42構(gòu)建的熒光探針,可以對人類乙酰膽堿受體與Pirenzepine之間的相互作用進(jìn)行研究。Phelps等用羅丹明和核黃素(Riboflavin)為受體給體對構(gòu)建的熒光探針,可以研究真核細(xì)胞中核黃素的遷移變化,并可對核黃素進(jìn)行亞細(xì)胞定位。圖1利用分子內(nèi)的熒光共振能量轉(zhuǎn)移研究轉(zhuǎn)肽酶

13、催化的肽轉(zhuǎn)移反應(yīng)43Fig.1ApplicationofintramolecularFRETtoanalysisofthesortasecatalyzedtranspeptidasereaction4318化學(xué)通報(bào)2009年第1期http:由羅丹明組成的熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針也可以研究生物分子間的生化反應(yīng)。在對轉(zhuǎn)肽酶催化的肽轉(zhuǎn)移反應(yīng)的研究中,兩段分別被羅丹明和熒光素標(biāo)記的特定縮氨酸片段,通過轉(zhuǎn)肽酶(Sortase)催化的肽轉(zhuǎn)移反應(yīng),得到一個(gè)可以發(fā)生FRET的產(chǎn)物分子(圖1)。通過檢測反應(yīng)過程中的熒光變化可以方便地研43究整個(gè)生化反應(yīng)。5其他應(yīng)用用羅丹明熒光探針可以測定活體

14、細(xì)胞內(nèi)的pH范圍和膜電位。熒光探針法在測試效率上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的電化學(xué)方法,所以該技術(shù)可用于高通量藥物篩選。通過熒光探針與細(xì)胞骨架、48,49究,這是免疫熒光組織化學(xué)的重要研究內(nèi)容,。筆者課50題組影,。4446476結(jié)語從1887年羅丹明B被合成出來至今的一百多年來,羅丹明類化合物已發(fā)展出幾十個(gè)品種,由它們制備的熒光探針廣泛地應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科。目前,對羅丹明熒光探針在生化分析領(lǐng)域的研究主要集中在兩個(gè)方面:第一,增加羅丹明分子的共平面性、結(jié)構(gòu)剛性以及增大分子電子共軛體系,用以提高熒光量子產(chǎn)率和發(fā)射波長,以減少生物分子背景熒光的干擾,增加檢測靈敏度;第二,在羅丹明母體上引入特定的基團(tuán)以

15、實(shí)現(xiàn)羅丹明熒光探針的特殊功能,使其具有更好的選擇性和生物親和性。隨著羅丹明熒光探針的檢測靈敏度、特異選擇性和生物親和性的不斷提高,羅丹明熒光探針在生化分析中的應(yīng)用也會越來越廣泛。參2王紅,張華山.化學(xué)進(jìn)展,2007,19(5):633642.3何晶,石景,傅堯.化學(xué)通報(bào),2007,70(7):507512.4顏范勇,陳立功,閆喜龍等.化學(xué)進(jìn)展,2006,18(23):252253.5姚型軍,袁倩,劉道杰等.理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊,2006,42(6):499504.6高勇,田敏,張斌等.有機(jī)化學(xué),2007,27(2):269271.7侯凌燕,章竹君,周福林.分析化學(xué),2007,35(2):28528

16、8.8莊會榮,馮尚彩,平梅.理化檢驗(yàn)化學(xué)分冊,2001,37(3):143145.9YKYang,KJYook,JTae.J.Am.Chem.Soc.,2005,127(48):1676016761.10JSWu,ICHwang,KSKimetal.Org.Lett.,2007,9(5):907910.11HYang,ZGZhou,KWHuangetal.Org.Lett.,2007,9(23):47294732.12MKumano,DJCarroll,JMDenuetal.Dev.Biol.,2001,236(1):244257.13JZou,AMHofer,MMLurtzetal.Bioc

17、hemestry,2007,46(43):1227512288114黃曉峰,張遠(yuǎn)強(qiáng),張英起.熒光探針技術(shù).北京:人民軍醫(yī)出版社,2004:234238115SGaillard,AYakovlev,CLuccardinietal.Org.Lett.,2007,9(14):26292632.16HKojima,MHirotani,NNakatsuboetal.Anal.Chem.,2001,73:19671973.17HKojima,MHirotani,YUrano.Tetrahed.Lett.,2000,41:6972.18BTang,YLXing,PLietal.J.Am.Chem.Soc.,

18、2007,129(38):1166611667.19SKenmoku,YUrano,HKojimaetal.J.Am.Chem.Soc.,2007,129(23):73137318.20VDujols,FFord,AWCzamik.J.Am.Chem.Soc.,1997,119:73867387.21MHLee,HJKim,SYoonetal.Org.Lett.,2008,10(2):213216.22劉曉翌,劉建軍.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2004,25(6):742745.23SXCai,HZZhang,JGuastellaetal.Bioorg.Med.Chem.Lett.,2001,1

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