光氣吸入對(duì)大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響

1、    光氣吸入對(duì)大鼠肺組織基因表達(dá)譜的影響            作者：蔡鋒雷，海春旭，張曉時(shí)間：2007-11-22 11:42:00                     【摘要】  目的： 研究光氣吸入染毒前后大鼠肺組織

2、基因表達(dá)的差異，探討光氣肺損傷作用相關(guān)的基因譜. 方法： 提取正常對(duì)照組和光氣染毒組肺組織的總RNA，并以此為模板制備熒光標(biāo)記的cRNA靶物，經(jīng)雜交、洗滌后，通過掃描熒光強(qiáng)度和計(jì)算機(jī)軟件分析，尋找染毒前后上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因. 結(jié)果： 在大鼠20500個(gè)靶基因中，初步篩選出801條差異表達(dá)基因，表達(dá)上調(diào)的有557條，下調(diào)的有254條. 根據(jù)基因的生物學(xué)功能，差異表達(dá)基因被分為9類：G1自由基電子傳遞相關(guān)；G2 應(yīng)激炎癥相關(guān)；G3 物質(zhì)代謝相關(guān)；G4 細(xì)胞增殖分化凋亡相關(guān)；G5 基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)；G6 受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)；G7 蛋白質(zhì)修飾分解相關(guān)；G8 細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)相關(guān)；G9 離子通道與物質(zhì)

3、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)等. 結(jié)論：光氣可以引起肺組織基因的多發(fā)性改變，其差異表達(dá)基因的功能分類為進(jìn)一步探討光氣中毒發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制和有效救治提供新的線索和思路. 【關(guān)鍵詞】  光氣；肺/損傷；寡核苷酸序列分析；基因表達(dá)光氣（phosgene,COCl2）又稱碳酰氯，屬于高毒類窒息性毒劑，是合成化工產(chǎn)品的重要原料，廣泛用于涂料、農(nóng)藥、塑料和紡織品等生產(chǎn)領(lǐng)域，由于揮發(fā)溫度低（8.2）、分散度高、反應(yīng)快速，而被認(rèn)為是具有高度潛在危險(xiǎn)的恐怖武器1-2. 光氣的主要毒性作用是對(duì)呼吸系統(tǒng)的損害，引發(fā)肺水腫3，但其中毒機(jī)制截至目前尚未完全闡明，臨床治療亦無特效措施4-5. 我們利用基因芯片技術(shù)，探討光氣染毒后大

4、鼠肺組織基因表達(dá)譜的改變以及差異表達(dá)基因與肺損傷的關(guān)系，旨在從新的角度對(duì)光氣中毒機(jī)制進(jìn)行闡述.1材料和方法1.1材料SD大鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量145 g 170 g,（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；TRIzol Reagent （美國(guó)Invitrogen公司）；cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒（Lifegen公司）；RNA純化試劑盒（荷蘭Qiagen公司）；芯片雜交試劑盒（美國(guó)Agilent公司）；雜交箱（美國(guó)UVP公司，HL2000型）；芯片掃描儀（美國(guó)Axon公司，4000B型）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司，G800型）.1.2方法將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和染毒組，每組5只. 正常組未在光氣中暴

5、露，染毒組給予光氣染毒（38 mg/L， 1 min）. 4 h后分別將兩組動(dòng)物按20 mg/Kg 用10 g/L戊巴比妥鈉麻醉，充分暴露胸腔，左心房開放后經(jīng)右心室沿肺動(dòng)脈注入無RNA酶的水對(duì)肺組織進(jìn)行灌洗以盡量排盡血液，最后在肺的同一部位剪取肺組織，經(jīng)TRIzol處理，迅速置于液氮中保存.標(biāo)記用RIzol試劑一步法抽提細(xì)胞總RNA，并用甲醛凝膠電泳，檢測(cè)總RNA樣本的質(zhì)量；用紫外分光光度計(jì)，分別在260 nm，280 nm處檢測(cè)cRNA的產(chǎn)量和純度. 用cRNA擴(kuò)增與標(biāo)記試劑盒對(duì)靶物進(jìn)行Cy3或Cy5熒光標(biāo)記，用RNA純化試劑盒對(duì)標(biāo)記靶物進(jìn)行純化，分別在550 nm，650 nm處檢測(cè)Cy3

6、和Cy5的熒光強(qiáng)度，以評(píng)估熒光標(biāo)記效率.芯片探針長(zhǎng)度60 mer，共包括22575個(gè)樣點(diǎn)，其中覆蓋大鼠基因20 500個(gè)，positive control探針913個(gè)，negative control探針162個(gè)，空白探針1000個(gè). 按照芯片雜交試劑盒提供的操作標(biāo)準(zhǔn)，將芯片和cRNA熒光標(biāo)記靶物進(jìn)行雜交. 經(jīng)洗滌后，室溫500 r/min離心10 min，甩干芯片表面液體，取出后立即進(jìn)行掃描.將清洗甩干的芯片置于Axon 4000B型掃描儀中，用Genepix3.0軟件進(jìn)行圖像掃描，得到芯片雜交圖譜，讀取每個(gè)樣點(diǎn)的原始熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，并對(duì)讀取的數(shù)據(jù)用Spotfire 8.0軟件進(jìn)行分析，經(jīng)歸一

7、化處理后，制作基因差異表達(dá)分析散點(diǎn)圖. 導(dǎo)出上調(diào)基因和下調(diào)基因列表. 判斷基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)R2時(shí)表示基因上調(diào)；R0.5時(shí)表示基因下調(diào)；當(dāng)0.5<R<2時(shí)則認(rèn)為基因無差異表達(dá).< p> 2結(jié)果2.1總RNA提取質(zhì)量RNA甲醛凝膠電泳顯示，28 s，18 s兩條帶清晰完整，證實(shí)提取的RNA無降解（圖1）. 經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析，A260 nm/A280 nm值均為2.0，說明制備的RNA純度較高，符合實(shí)驗(yàn)要求.2.2cRNA標(biāo)記效率以效率大于8 mol/g視為標(biāo)記有效，計(jì)算得熒光標(biāo)記效率分別為9.81 mol/g和9.04 mol/g，符合參加雜交反應(yīng)的條件.2.3芯

8、片雜交結(jié)果經(jīng)對(duì)雙色熒光標(biāo)記雜交掃描圖譜和基因表達(dá)分析散點(diǎn)圖進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，在大鼠20 500個(gè)靶基因中，染毒組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)的基因有557條，其中已知基因433條，未知基因124條；下調(diào)的基因有254條，其中已知基因205條，未知基因49條. 部分顯著變化的基因（表1）. 表1光氣染毒后肺組織的部分差異表達(dá)基因（略）經(jīng)基因生物學(xué)功能分析，將差異表達(dá)基因分為9類，其功能已知基因分類結(jié)果顯示，光氣染毒后細(xì)胞的能量生成下降，包括：參與糖有氧代謝的基因表達(dá)下調(diào)，如NM033235，編碼蘋果酸脫氫酶1；而參與糖異生和糖無氧酵解的基因表達(dá)上調(diào)，如BI277389，編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1. 與能

9、量水平密切相關(guān)的部分功能基因也表達(dá)異常，如NM053578基因下調(diào)，編碼ATP酶H+轉(zhuǎn)運(yùn)溶酶體9kDaV0亞基e，參與ATP合成偶聯(lián)的質(zhì)子運(yùn)輸；NM022235基因上調(diào)，編碼鉀電壓閥門通道Isk相關(guān)家族成員3，參與K離子轉(zhuǎn)運(yùn)等（表2）. 表2差異表達(dá)基因的分類及數(shù)目（略）3討論近年來，光氣作為重要的化工原料，在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用等過程中，對(duì)人員和環(huán)境造成了嚴(yán)重危害6. 光氣吸入中毒最顯著的臨床表現(xiàn)是肺水腫的形成，也是中毒人員致死的主要原因. 我們利用基因芯片技術(shù)，對(duì)光氣染毒前后的基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析. 從差異基因數(shù)量來看，差異表達(dá)在兩倍以上的基因達(dá)801條，占靶基因總數(shù)的3.9%，說明光氣可以引

10、起肺組織基因的多發(fā)性改變，證實(shí)了光氣致肺水腫的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因調(diào)控的過程7，提示在正常肺組織細(xì)胞中可能存在著相當(dāng)數(shù)量的基因容易受到有毒化學(xué)物的作用而發(fā)生改變，其基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜而又不穩(wěn)定的生物學(xué)過程，有人稱之為“不穩(wěn)定型基因組”8. 表1所列出的部分變化顯著的功能基因可能是光氣毒性作用的敏感基因或靶標(biāo)基因.從差異基因功能來看，很大一部分差異表達(dá)基因與細(xì)胞的基本生理功能有關(guān)，說明此類基因參與的生物過程比較復(fù)雜. 測(cè)定結(jié)果和統(tǒng)計(jì)分析也表明，與自由基、電子傳遞相關(guān)的基因，雖然其差異表達(dá)基因的數(shù)量較少，但秦緒軍等9的報(bào)道，自由基損傷在光氣中毒過程中起著重要作用. 我們的結(jié)果顯示，上調(diào)的BF55

11、6648編碼金屬硫蛋白1和金屬硫蛋白2，通過與金屬離子結(jié)合，參與電子傳遞，發(fā)揮抗氧化劑作用10；下調(diào)的NM012611編碼誘生型一氧化氮合成酶，參與NO生物合成，NO作為體內(nèi)十分活躍的自由基分子，與分子氧、超氧陰離子及一些金屬離子發(fā)生反應(yīng)，可引起廣泛的自由基損傷11. 此結(jié)果從基因水平表明自由基確實(shí)在光氣中毒過程中扮演著重要角色，當(dāng)光氣引發(fā)自由基產(chǎn)生時(shí)，機(jī)體通過自身代償，在一定程度上減輕了自由基的損傷作用. 同時(shí)也提示我們，利用復(fù)合抗氧化劑進(jìn)行光氣吸入后的早期治療，可能會(huì)有效地提高救治效果.經(jīng)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，我們認(rèn)為光氣中毒可能存在如下機(jī)制：光氣吸入肺組織以后，在發(fā)生即時(shí)性理化損傷

12、作用的同時(shí)也引起了肺組織“不穩(wěn)定基因”的差異表達(dá)，其中與自由基、電子傳遞相關(guān)的基因，首先引起生物電化學(xué)平衡的紊亂，可能是引起肺組織延時(shí)性損傷的起始動(dòng)因；受之影響，與物質(zhì)代謝、細(xì)胞分裂、基因表達(dá)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因相繼也發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞基本生理功能障礙，其中能量代謝水平的異常，可能是引起細(xì)胞其它功能障礙的最根本原因；最后，當(dāng)損傷積累到一定程度，細(xì)胞失去代償能力，細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)受損，離子通道及物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)，可能是各類細(xì)胞損傷的最終結(jié)果，也是引發(fā)肺水腫的直接原因.【參考文獻(xiàn)】  1Burklow TR, Yu CE, Madsen JM. Industrial chemicals: T

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