糖尿病大鼠腎小球及內(nèi)髓集合管細(xì)胞對(duì)一氧化氮反應(yīng)的異常

1、    糖尿病大鼠腎小球及內(nèi)髓集合管 細(xì)胞對(duì)一氧化氮反應(yīng)的異常        目的觀察糖尿病大鼠腎臟中一氧化氮(NO)依賴性3，5-環(huán)-磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)的改變，推測(cè)NO在糖尿病腎病中的可能作用。方法分離腎小球及內(nèi)髓集合管(IMCD)細(xì)胞，采用放免法測(cè)定cGMP含量。結(jié)果糖尿病大鼠腎小球cGMP基礎(chǔ)水平明顯升高，NG-單甲基L精氨酸(L-NMA)僅可部分糾正該異常，腎小球?qū)-精氨酸、乙酰膽堿及硝普鈉的刺激反應(yīng)明顯減弱。IMCD細(xì)胞對(duì)L-精氨酸的反應(yīng)也下降。結(jié)論糖

2、尿病大鼠腎小球及IMCD細(xì)胞均存在NO代謝異常。關(guān)鍵詞糖尿病腎小球內(nèi)髓集合管一氧化氮cGMPExistence of an abnormal nitric oxide metabolism seen in glomeruli and inner medullary collecting duct cells of diabetic ratsGu Yong, Chen Jing, Sun Jianhua, et al. Department of Nephrology, Huashan Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200040O

3、bjectiveTo investigate the NO-dependent cGMP production in the kidney of diabetic rats in order to elucidate the probable role of NO in diabetic nephropathy. MethodsThe levels of cGMP in isolated glomeruli and IMCD cells were measured by radioimmunoassary. ResultsDiabetic glomeruli had enhanced gene

4、ration of cGMP under basal state, which could be incompletely inhibited by L-NMA, but failed to further response to L-arginine, acetylcholin and sodium nitroprusside. An attenuated response to L-arginine was also found in diabetic IMCD cells. ConclusionBoth diabetic glomeruli and IMCD cells had an a

5、bnormal NO metabolism.Key wordsDiabetesGlomeruliIMCDNOcGMP腎臟早期血流動(dòng)力學(xué)異常(如腎小球高濾過(guò)、高灌注等)是糖尿病腎病慢性進(jìn)展的主要原因，其確切機(jī)制仍不清楚1。新近研究表明內(nèi)皮來(lái)源性舒張因子(EDRF)一氧化氮(NO)在腎臟血流動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)方面起重要作用2。為此，我們觀察了糖尿病大鼠腎小球及內(nèi)髓集合管細(xì)胞中NO依賴性3、5-環(huán)-磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)的基礎(chǔ)水平及其對(duì)NO刺激劑(L-精氨酸、乙酰膽堿及硝普鈉)或抑制劑NG-單甲基L精氨酸(L-NMA)的反應(yīng)。旨在探討NO在糖尿病腎病血流動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)作用。 材料與方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重約200克

6、的健康雄性SD大鼠隨機(jī)分成(1)糖尿病組(n=8)，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(50 mg/kg體重)，2448小時(shí)后尿糖陽(yáng)性確定模型成功；(2)正常對(duì)照組(n=8)，腹腔注射等劑量生理鹽水。各組動(dòng)物自由飲食，14天后斷頭取血測(cè)血糖，腎臟經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注林格氏液后用于下一步實(shí)驗(yàn)。二、腎小球制備取腎皮質(zhì)切碎成糊狀，通過(guò)孔徑104 m及75 m的不銹鋼篩網(wǎng)，前者可去除腎小管及血管組織，而阻留在75 m網(wǎng)上的為腎小球。用Tris-Hcl緩沖液(135 mmol/L NaCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L醋酸鈉，5 mmol/L葡萄糖，pH7.4)洗滌離心(12 000 r/min，4分鐘)

7、，制成懸液備用3。三、IMCD細(xì)胞制備取腎乳頭切碎后置于含0.1%膠原酶及0.01% DNA酶的Krebs液(145 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl，1 mmol/L Na2HPO4,2.5 mmol/L CaCl2,1.8 mmol/L MgSO4,5 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L Hepes,pH7.3)中，37孵育1小時(shí)，加入蒸餾水使其滲透濃度降至120 mmol/L，除IMCD細(xì)胞外其它細(xì)胞均被低滲破壞。再用含10%牛血清白蛋白的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞23次，最后將細(xì)胞沉淀懸浮于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備用4。四、細(xì)胞孵育及cGMP測(cè)定將分離的腎小球

8、及內(nèi)髓集合管細(xì)胞各取50 l為一管，37預(yù)孵育10分鐘。隨后加入50 l Hepes緩沖液(137 mmol/L NaCl，5.4 mmol/L KCl，0.34 mmol/L Na2HPO4,0.44 mmol/L KH2PO4,1 mmol/L CaCl2,0.5 mmol/L MgCl2,0.5 mmol/L葡萄糖，20 mmol/L Hepes,pH7.4),其中分別含有不同濃度L-精氨酸(L-arg 10-410-2mol/L)，L-精氨酸(10-410-2 mol/L)+L-NMA(10-3 mol/L)，乙酰膽堿(Ach 10-610-3 mol/L)，硝普鈉(SNP 10-61

9、0-3 mol/L)或心房利鈉肽(ANP 10-910-6 mol/L)，同時(shí)加入3-異丁基-甲基黃嘌呤(IBM X 1m)，3分鐘后加入10%三氯乙酸100 l，中斷反應(yīng)。離心取上清液，用1 ml水飽和乙醚抽提三次，用吹風(fēng)機(jī)吹干(45)，干燥樣品加入250 l醋酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH7.3)，取100 l移入試管中進(jìn)行cGMP放免測(cè)定。沉淀按Lowry法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。cGMP含量用pg/g蛋白表示。五、統(tǒng)計(jì)方法所有數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗(yàn)及方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以P<0.05示有顯著性差異。結(jié)果1L-NMA對(duì)各組大鼠腎小球經(jīng)不同濃度L-精氨酸刺激后cGM

10、P水平的影響* P<0.05 vs正常組；+ P<0.01 vs基礎(chǔ)值2乙酰膽堿對(duì)各組大鼠腎小球及IMCD細(xì)胞cGMP產(chǎn)生的影響* P<0.05，* P<0.01 vs正常組；+ P<0.05，? P<0.01 vs基礎(chǔ)值3硝普鈉對(duì)各組大鼠腎小球IMCD細(xì)胞cGMP產(chǎn)生的影響* P<0.05，* P<0.01 vs基礎(chǔ)值；+ P<0.05 vs正常值4L-NMA對(duì)各組大鼠IMCD細(xì)胞經(jīng)不同濃度L-精氨酸刺激后cGMP水平的影響* P<0.05，* P<0.01 vs正常組；+ P<0.05，? P<0.01 vs基礎(chǔ)

11、值討論體內(nèi)NO主要來(lái)源于L-精氨酸，在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下產(chǎn)生。NO可彌散至臨近平滑肌細(xì)胞中激活可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，刺激cGMP產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮擴(kuò)張血管平滑肌的作用5。我們采用細(xì)胞孵育加入IBMX阻斷cGMP降解的方法，實(shí)驗(yàn)所測(cè)cGMP值主要反應(yīng)cGMP的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)下糖尿病大鼠腎小球cGMP水平明顯升高，應(yīng)用NO生成抑制劑L-NMA以后6，可顯著降低該值，提示腎小球cGMP產(chǎn)生增加主要源于NO生成異常活躍。許多學(xué)者也曾發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)高濾過(guò)的糖尿病大鼠血中及尿中，NO2/NO3(NO主要的氧化代謝產(chǎn)物)和cGMP水平均明顯升高，支持NO代謝活躍7，8。但是L-NMA并不能完全

12、糾正糖尿病大鼠過(guò)高的cGMP水平。已知NOS可分成原生型及誘生型兩種，糖尿病時(shí)兩種酶的活力及表達(dá)均可能異常增加，也許誘生型NOS與L-NMA的親合力較弱，從而導(dǎo)致了上述結(jié)果；或者與非NO依賴性cGMP產(chǎn)生過(guò)多有關(guān)，因?yàn)樘悄虿?dòng)物體內(nèi)ANP分泌增多也很常見(jiàn)，后者可通過(guò)受體介導(dǎo)，激活顆粒型鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，使cGMP產(chǎn)生增加。我們發(fā)現(xiàn)外源性ANP對(duì)cGMP含量的影響在兩組動(dòng)物中沒(méi)有顯著差異，提示糖尿病大鼠腎小球中顆粒型鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶活性可能正常。糖尿病動(dòng)物腎小球?qū)O刺激的反應(yīng)也有障礙。L-精氨酸作用后，正常大鼠cGMP水平呈濃度依賴性升高，并可被L-NMA所阻斷；但糖尿病大鼠cGMP水平卻無(wú)明顯改變，

13、提示糖尿病時(shí)NO前體L-精氨酸無(wú)法進(jìn)一步激活NOS，NOS的活性或表達(dá)可能已達(dá)極限。Ach刺激后，糖尿病組cGMP上升幅度也顯著低于正常。已有人證實(shí)糖尿病時(shí)大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損及Ach引起內(nèi)皮來(lái)源性舒張因子(EDRF)釋放減少9。另外，SNP作用后亦可產(chǎn)生類似于Ach的反應(yīng)，由于SNP不依賴NOS，可直接釋放NO，經(jīng)可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶作用后產(chǎn)生cGMP，因此該結(jié)果提示糖尿病時(shí)此酶活性可能下降，與Wang YX等報(bào)道相一致10。由于糖尿病大鼠腎小球中NO依賴性cGMP產(chǎn)生顯著升高，可以推測(cè)NO合成增加可能與糖尿病早期高濾過(guò)有關(guān)。但是其內(nèi)皮細(xì)胞中亦存在著明顯的NO代謝障礙。由于腎小球包括多種細(xì)胞

14、，因此不能除外其它細(xì)胞(如系膜細(xì)胞等)中NO代謝異?；钴S，抵銷了內(nèi)皮細(xì)胞中cGMP產(chǎn)生的減少，進(jìn)而導(dǎo)致總cGMP產(chǎn)生增加，參與糖尿病早期腎臟血流動(dòng)力學(xué)異常。我們同時(shí)觀察了IMCD NO代謝情況。結(jié)果表明，IMCD細(xì)胞基礎(chǔ)cGMP水平及其對(duì)Ach、SNP刺激反應(yīng)在正常和糖尿病大鼠之間沒(méi)有顯著差別。但L-精氨酸刺激之后，糖尿病大鼠cGMP升高幅度低于正常，提示在糖尿病大鼠IMCD細(xì)胞中也存在NO代謝的異常，但其與糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。綜上所述，在基礎(chǔ)狀態(tài)下糖尿病大鼠腎小球cGMP水平明顯升高，對(duì)NO前體L-精氨酸、內(nèi)皮依賴性血管擴(kuò)張劑Ach及非NOS依賴性擴(kuò)血管藥SNP反應(yīng)降

15、低，IMCD細(xì)胞對(duì)L-精氨酸刺激反應(yīng)也減退。提示糖尿病大鼠腎小球及IMCD細(xì)胞均存在NO代謝異常，可能參與了糖尿病時(shí)腎臟血流動(dòng)力學(xué)的紊亂。參考文獻(xiàn)1Mogensen CE and Christensen CK. Predicting diabetic nephropathy in insulin-dependent patients. N Engl J Med, 1984,3118993.2Tolins JP, Palmer RMJ, Moncada S, et al. Role of endothelium-derived relaxing factor in regulation of r

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