二氟甲基鳥(niǎo)氨酸及反義bcl-2協(xié)同誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡

1、    二氟甲基鳥(niǎo)氨酸及反義bcl-2協(xié)同誘導(dǎo) HL60細(xì)胞凋亡        【摘要】目的觀察二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)及反義bcl-2調(diào)控bcl-2基因表達(dá)對(duì)HL60細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。方法構(gòu)建反義bcl-2逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體，建立產(chǎn)病毒細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，用形態(tài)觀察、生長(zhǎng)曲線、FCM分析、集落形成、DNA電泳譜、分子雜交及免疫組化等方法研究細(xì)胞生長(zhǎng)特性及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)。結(jié)果成功地構(gòu)建了反義bcl-2逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體及產(chǎn)病毒細(xì)胞系。以此轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，引起了

2、bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)下降，但生長(zhǎng)速率、細(xì)胞周期分布及鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC)基因表達(dá)水平與親本細(xì)胞比較差別不大；無(wú)明顯的細(xì)胞凋亡，僅集落形成能力有所減弱。用小劑量DFMO處理反義bcl-2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，不僅生長(zhǎng)受到明顯抑制，而且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)論DFMO與反義bcl-2對(duì)HL60細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)有協(xié)同作用。抑制bcl-2表達(dá)能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)DFMO作用的敏感性?！局黝}詞】二氟甲基鳥(niǎo)氨酸；反義bcl-2；HL60細(xì)胞；細(xì)胞凋亡Difluoromethylornithine synergizes with antisense bcl-2 RNA in the induction of

3、 apoptosis of HL60 cellsHE Junqi, FAN Muzhen, FANG Qing.（ Department of Biochemistry and Molecular Biology, China-Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029, China）【Abstract】ObjectiveTo study the combined effect of difluoromethylornithine (DFMO) and bcl-2 antisense RNA i

4、n the induction of apoptosis of HL60 cells.MethodsHL60 cells were transfected with recombinant retroviral vector expressing bcl-2 antisense RNA. The growth characteristics of transfectants were studied by morphological observation, growth curve, FCM analysis, colony formation in soft agar, DNA elect

5、rophoresis, molecular hybridization and immunocytochemical staining.ResultsThe recombinant retroviral vectors expressing bcl-2 antisense RNA and the cell line producing recombinant virus were constructed. Although the expression of bcl-2 at mRNA and protein levels in the HL60 cells transfected with

6、antisense bcl-2 were down-regulated, there was no change in cell growth, cell cycles and expression of ornithine decarboxylase (ODC) compared with the parental cells albeit some decrease in colony formation. In addition, transfection with antisense bcl-2 did not induce marked apoptosis whereas treat

7、ment of the transfectant with low concentration (0.2 mmol/L) of DFMO resulted in enhanced expression inhibition of bcl-2 protein, inhibition of cell growth and induction of apoptosis.ConclusionDFMO synergizes with antiense bcl-2 RNA in the induction of apoptosis of HL60 cells.【Subject words】Difluoro

8、methylomithine;Anti-sense bcl-2;HL60 cells;Apoptosis已有工作證明,多胺生物合成關(guān)鍵酶鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(ODC.EC4.1.1.17)的不可逆抑制劑二氟甲基鳥(niǎo)氨酸(DFMO)可有效地調(diào)節(jié)HL60細(xì)胞中某些與腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，如c-myc、c-fos、Ha-ras和bcl-2等1-6。反義ODC重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明，反義ODC表達(dá)及多胺生物合成抑制影響了相關(guān)癌基因的表達(dá)，使腫瘤惡性表型得到逆轉(zhuǎn)4。此外我們還觀察到，DFMO處理突變型Ha-rasval12基因轉(zhuǎn)染的小鼠成纖維細(xì)胞能逆轉(zhuǎn)其轉(zhuǎn)化表型7。以上結(jié)果顯示，多

9、胺在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡中起著重要作用，而且這種作用是通過(guò)多胺對(duì)某些相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。已知bcl-2基因表達(dá)產(chǎn)物可抑制細(xì)胞的凋亡8。為探討抑制多胺生物合成對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)是否與其對(duì)bcl-2表達(dá)抑制有關(guān)，我們觀察了DFMO及反義bcl-2 RNA對(duì)bcl-2基因表達(dá)調(diào)控及其對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響，以期進(jìn)一步了解抑制多胺生物合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，為以抗多胺生物合成作為抗癌新途徑提供有用的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法1.細(xì)胞培養(yǎng)：HL60細(xì)胞按常規(guī)條件培養(yǎng)(10%小牛血清/RPMI 1640，37，5% CO2)；-2、PA317和NIH3T3細(xì)胞在上述相同條件下于10%小

10、牛血清/DMEM中培養(yǎng)。2.細(xì)胞形態(tài)觀察：按常規(guī)Giemsa染色法進(jìn)行，每日收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察生長(zhǎng)情況。3.重組體構(gòu)建：以逆轉(zhuǎn)錄病毒pBC140(10.2 kb)經(jīng)Xho 酶切脫磷酸化處理作為載體。含有人bcl-2 cDNA序列的質(zhì)粒pBC123，經(jīng)Xho 酶切得到0.9 kb片段。載體與插入片段按1416比例進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)電泳檢查，獲bcl-2as/pBC140(反義)及bcl-2s/pBC140(正義)重組體。以真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3(5.4 kb)為載體，經(jīng)Xho 酶切后與bcl-2片段(0.9 kb)連接，酶切鑒定證明分別得到bcl-2as/pcDNA3(反義)及bcl-2s/

11、pcDNA3(正義)重組質(zhì)粒。用Not 酶切線型化，體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，分別得到與bcl-2 mRNA及反義bcl-2 RNA互補(bǔ)的單鏈探針。4.產(chǎn)病毒細(xì)胞系建立：用磷酸鈣共沉淀法以bcl-2as/pBC140重組體轉(zhuǎn)染單向包裝細(xì)胞系-2，48 h后收集-2細(xì)胞出芽的病毒顆粒，再感染雙向性包裝細(xì)胞系PA317。經(jīng)G418選擇培養(yǎng)1014 d，篩選得到攜有反義bcl-2逆轉(zhuǎn)錄病毒重組體的PA317克隆。用bcl-2 cDNA（0.95 kb）作為探針，Southern blot分析證明含有bcl-2as重組體在前病毒DNA的整合。NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，其病毒滴度為1.1×1053

12、.0×105。5.HL60細(xì)胞感染：2×105 HL60細(xì)胞/10 ml培養(yǎng)基加1 ml新鮮病毒上清培養(yǎng)，24 h后換含有G418(800 g/ml)的培養(yǎng)基，每23 d換液1次。2周后取少量細(xì)胞至24孔板中繼續(xù)選擇培養(yǎng)2周，抗性克隆細(xì)胞再進(jìn)行大量培養(yǎng)，其基因組DNA經(jīng)EcoR酶切，用0.95 kb bcl-2 cDNA作探針進(jìn)行Southern blot分析，證明前病毒在細(xì)胞中的整合。6.bcl-2及ODC基因表達(dá)9：常規(guī)法提取細(xì)胞總RNA，電泳鑒定RNA質(zhì)量，采用Promega公司試劑盒。在重組質(zhì)粒bcl-2s/ pcDNA3及bcl-2s/pcDNA3中，T7啟動(dòng)子在

13、T7RNA聚合酶作用下，體外轉(zhuǎn)染得到正義及反義單鏈探針，分別檢測(cè)bcl-2 mRNA及反義bcl-2 RNA的表達(dá)。用質(zhì)粒pODC10/2H(J?nmi OA博士惠贈(zèng))作探針，檢測(cè)ODC基因表達(dá)。7.流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：收集培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌后，70%乙醇固定，RNase A處理，碘化丙啶染色，F(xiàn)CM檢測(cè)細(xì)胞凋亡。8.軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)：按常規(guī)方法4進(jìn)行。9.bcl-2蛋白表達(dá)：采用美國(guó)Sant cruz技術(shù)公司的bcl-2單抗及免疫組化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果一、bcl-2逆轉(zhuǎn)錄病毒及bcl-2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及產(chǎn)病毒細(xì)胞系的建立成功地構(gòu)建了bcl-2as/pBC140、bc

14、l-2s/pBC140、bcl-2as/pcDNA3及bcl-2s/pcDNA3重組體。酶切譜鑒定了其重組的正確性。用bcl-2as/pBC140建立的產(chǎn)病毒細(xì)胞系，其滴度在5×1036×105范圍內(nèi)，其中2株P(guān)A317細(xì)胞產(chǎn)病毒滴度分別為1.1×105和3.0×105，并用Southern blot證明有完整前病毒整合。二、bcl-2as轉(zhuǎn)染細(xì)胞HL60/bcl-2as 的生長(zhǎng)特性1.生長(zhǎng)曲線：轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與其親本細(xì)胞HL60比較，沒(méi)有明顯差別(1)。1HL60/bcl-2as細(xì)胞生長(zhǎng)曲線2.細(xì)胞周期分布：FCM分析結(jié)果表明，與親本細(xì)胞及空載體轉(zhuǎn)染

15、細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的周期分布沒(méi)有顯著變化(表1)。表1細(xì)胞周期分布細(xì)胞細(xì)胞周期分布(%)G0、G1SG2、MHL60255817HL60/neo275914HL60/bcl-2as2952193.集落形成：軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HL60/bcl-2as轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落形成能力比親本細(xì)胞及空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞明顯減弱，其集落形成效率分別為27%、89%和92%。4.細(xì)胞凋亡：細(xì)胞形態(tài)、FCM分析及DNA電泳譜顯示，bcl-2as的轉(zhuǎn)染對(duì)HL60細(xì)胞凋亡的影響不甚顯著(24)。 2 細(xì)胞形態(tài)。2a:HL60；2b：HL60+0。2mmol/L DFMO;2c：HL60/bcl-2as;2d：HL6

16、0/bcl-2as+DFMO(0.2mmol/L)A：HL60；B：HL60+0.2 mmol/L DFMO；C：HL60/bcl-2as；D：HL60/bcl-2as+0.2 mmol/L DFMO；AP：凋亡峰3FCM分析A：DNA/Hind；B：HL60；C：HL60/bcl-2as；D：HL60+0.2 mmol/L DFMO；E：HL60/bcl-2as+0.2 mmol/L DFMO 4DNA電泳5.bcl-2及ODC基因表達(dá)：點(diǎn)雜交及免疫組化檢測(cè)表明，反義bcl-2轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞有反義bcl-2 mRNA表達(dá)，使bcl-2蛋白表達(dá)減弱，而ODC mRNA表達(dá)沒(méi)有受到影響(5)。

17、5 Bcl-2蛋白表達(dá)。5a:HL60;5b:HL60+0.2mmol/L DFMO;5c:HL60/bcl-2as;5d:HL60/bcl-2as+0.2mmol/L DFMO三、DFMO對(duì)HL60/bcl-2as轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響小劑量DFMO(0.2 mmol/L)不僅能引起HL60細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑制，而且使HL60/bcl-2as細(xì)胞生長(zhǎng)有更顯著的抑制(1)。形態(tài)觀察表明，DFMO處理HL60/bcl-2as細(xì)胞第4天即可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，核仁消失，核崩解，胞漿出現(xiàn)空泡，呈現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象。電泳譜及FCM分析顯示，小劑量DFMO使DNA斷裂及凋亡峰更為明顯。四、DFMO對(duì)HL60/bc

18、l-2as細(xì)胞bcL-2蛋白表達(dá)的影響免疫組化法檢測(cè)bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果表明，小劑量DFMO亦能加強(qiáng)反義bcl-2 RNA對(duì)bcl-2蛋白表達(dá)的抑制作用(5)。討論自從80年代中期發(fā)現(xiàn)bcl-2原癌基因以來(lái)，相繼的研究工作證明，該基因在多細(xì)胞生物的細(xì)胞程序死亡（凋亡）途徑中起著重要作用。近年又發(fā)現(xiàn)了bcl-2家族的多種相關(guān)基因均與細(xì)胞凋亡有關(guān)10。雖然目前對(duì)bcl-2蛋白功能的研究尚有待深入，但它們的去調(diào)節(jié)可影響細(xì)胞程序死亡，從而導(dǎo)致有關(guān)疾病的發(fā)生11。現(xiàn)有研究認(rèn)為，癌癥的發(fā)生是細(xì)胞過(guò)度增殖及凋亡不足引起細(xì)胞過(guò)分堆積，使細(xì)胞數(shù)平衡失調(diào)所致?？拱┭芯窟^(guò)去多集中考慮抗細(xì)胞增殖，近年逐漸轉(zhuǎn)向誘導(dǎo)細(xì)

19、胞凋亡。我們以往在體外及體內(nèi)的研究均證明了抑制多胺生物合成能有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化，減低腫瘤細(xì)胞的致瘤性，而且亦反復(fù)證實(shí)了抑制多胺生物合成對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡有誘導(dǎo)作用，而這些變化與其對(duì)c-myc、Ha-ras、bcl-2相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)1，3-5。本研究結(jié)果顯示，HL60/bcl-2as細(xì)胞的bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)受到抑制，但細(xì)胞生長(zhǎng)速率、周期分布及凋亡均未受明顯影響。而在軟瓊脂上集落形成能力有所減弱，可能是由于細(xì)胞凋亡是多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，封閉其中單個(gè)有關(guān)基因(bcl-2)的表達(dá)，尚不能達(dá)到明顯影響腫瘤細(xì)胞惡性表型的結(jié)果。當(dāng)用DFMO處理HL60/bcl-2as細(xì)胞

20、時(shí)，即使是小劑量的DFMO(0.2 mmol/L)，亦能加強(qiáng)bcl-2as對(duì)bcl-2蛋白的表達(dá)抑制；而bcl-2蛋白表達(dá)抑制反過(guò)來(lái)又增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)DFMO誘導(dǎo)凋亡及抑制增殖的敏感性，因而引起了明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)現(xiàn)象。這一現(xiàn)象顯示了抑制多胺生物合成與反義bcl-2封閉Bcl-2表達(dá)在改變惡性表型中的協(xié)同作用。本研究結(jié)果提示，多胺生物合成抑制，有可能從控制增殖和誘導(dǎo)凋亡兩個(gè)方面阻止惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，是惡性腫瘤防治研究中值得探索的一條重要途徑。作者單位：賀俊崎（中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所生化及分子生物學(xué)室，北京，100029）范慕貞（中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所生化及分子生物學(xué)室，北京，1000

21、29）房青（中日友好臨床醫(yī)學(xué)研究所生化及分子生物學(xué)室，北京，100029）參考文獻(xiàn)：1范慕貞，齊上樂(lè)，趙成龍，等.多胺生物合成抑制劑-DFMO對(duì)HL60細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及c-myc和c-fos基因表達(dá)的影響.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1989，16：455-458.2吳克斌，范慕貞.抗多胺代謝與HL60細(xì)胞c-myc、c-fos、c-Ha-ras及ODC基因表達(dá).中日友好醫(yī)院學(xué)報(bào)，1992，6增刊：224-226.3馮立新，范慕貞.多胺生物合成抑制誘導(dǎo)HL60細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的克隆及表達(dá).中華腫瘤雜志，1998,20:274-276.4Guan Jun, Fan Muzhen, Cao Shulan. Reversion of malignant phenotypes of human lung squamous carcinoma cells by ornithine decarboxylase antisense RNA. Chinese J Cancer Res, 1996,8:240-243