Survivin反義核酸影響A549肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的研究

1、Survivin反義核酸影響A549肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的研究                      作者：鄭人源蒲鈴玲劉樺潘克儉王玉明     【摘要】  目的研究Survivin反義寡核苷酸對A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法針對Survivin mRNA序列設(shè)計了反義寡核甘酸，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，PT-PCR檢測細(xì)胞中survivi

2、n基因的mRNA含量；Western印跡顯示Survivin蛋白水平；以MTT法檢測細(xì)胞增殖，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果Survivin反義寡核苷酸可明顯降低A549細(xì)胞中survivin的mRNA和蛋白水平。MTT比色法結(jié)果說明人Survivin反義寡核苷酸抑制A549細(xì)胞增殖，抑制率遠(yuǎn)高于無義寡核苷酸組和空白對照組。TUNEL法檢測結(jié)果顯示，反義寡核苷酸還顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞對抗腫瘤藥高三尖杉酯堿的敏感性，在較低高三尖杉酯堿濃度下，反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率明顯高于其它對照組。結(jié)論survivin反義寡核苷酸有望應(yīng)用于腫瘤的輔助治療之中。 【關(guān)鍵詞】  Survivin；反

3、義寡核苷酸；A549細(xì)胞；增殖；凋亡    Abstract：Objective To investigate the effect of survivin antisense oligonucleotide to the proliferation and apoptosis of A549 cells.Methods Designed a human survivin antisense oligonucleotides and transfected it into A549 cells.The expression of survivin mRNA and

4、 the level of protein were detected by RT-PCR and Western blot methods respectively.The MTT assay was used to detect the cell proliferation and the apoptotic rates were measured by TUNEL assay.Results The quantity of survivin mRNA and the level of protein were decreased by this antisense oligonucleo

5、tide.The antisense oligonucleotides had a inhibitory rate of proliferation which was much higher than the rate of the control.The apoptotic rate obtained by transfecting cells with antisense oligonucleotide was higher than the rate of control which all exposed to the low concentration of homoharring

6、tonine.Conclusion The experiment results indicate that antisense oligonucleotide can deserve as an approach to subservient tumor therapy in future.    Key words：Survivin;antisense oligonucleotide;A549 cell;proliferation;apoptosisSurvivin（存活素）屬于凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein,I

7、AP)家族，具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡功能，通常以二聚體形式存在，與Caspase二聚體以均稱對等方式結(jié)合，從而抑制后者活性，進(jìn)而抑制了細(xì)胞凋亡1；也可活化CDK4（周期蛋白依賴性激酶4），使細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，導(dǎo)致大量細(xì)胞無限制生長2。在正常生理狀態(tài)下，Survivin不在終末分化的成人組織表達(dá)。但在絕大多數(shù)癌組織中表達(dá)，而且隨著癌前細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，其表達(dá)逐漸升高3，4。腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移與預(yù)后密切相關(guān)。正常細(xì)胞脫離原來的組織時會啟動凋亡過程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究認(rèn)為，在惡性腫瘤中，脫落的癌細(xì)胞因?yàn)镾urvivin對凋亡的抑制而受到了保護(hù)，得以繼續(xù)存活并分裂增殖，進(jìn)而進(jìn)行遠(yuǎn)離部位的轉(zhuǎn)移，形成腫瘤。從

8、而使病人預(yù)后不良5。因此認(rèn)為Survivin的存在代表著正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生物學(xué)行為特征。本研究針對Survivin mRNA序列設(shè)計了反義寡核苷酸，抑制Survivin蛋白的合成，驗(yàn)證了Survivin反義寡核苷酸能抑制A549細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞對抗腫瘤藥物高三尖杉酯堿（homoharringtonine,HHT）的敏感性。    1材料與方法    1.1試劑和細(xì)胞株    A549肺癌細(xì)胞株由四川大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室贈送。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrog

9、en公司；MTT(噻唑藍(lán))購自Santa Cruz公司；兔抗Survivin多克隆抗體購自Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL試劑購自Gibco公司；PVDF膜購自Millipore公司；ECL試劑盒購于博士德公司；細(xì)胞凋亡DNA片段原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購自Boehringer Mannheim公司。高三尖杉酯堿購于四川大學(xué)華西醫(yī)院藥房。    1.2反義寡核苷酸    應(yīng)用RNA structure 315對人survivin mRNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬,依此設(shè)計并合成了反義

10、寡核苷酸ASODN鏈和無義鏈，兩端各有5個堿基硫代修飾,由上海生工公司合成。    反義寡核苷酸序列：5-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3    無義寡核苷酸序列：5-GCCACTCCTCGACTCTCGTG-3    1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染    A649細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37,5%CO2中培養(yǎng),胰酶消化,計數(shù),分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞6 000個)和6孔板，37培養(yǎng)過夜,在LipofectamineTM2 000脂質(zhì)體介導(dǎo)下

11、進(jìn)行反義寡核苷酸和無義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染,空白對照組孔內(nèi)加入含相同濃度脂質(zhì)體的RPMI 1640培養(yǎng)液。6h后移去含脂質(zhì)體的培養(yǎng)液，換為含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。    1.4RT-PCR檢測    TRIZOL法提取6孔板內(nèi)細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度儀定量；各樣本取1g總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取cDNA 5l/樣本，加Survivin PCR引物，同時加入-actin引物作為內(nèi)對照，雙引物常規(guī)PCR反應(yīng)，25個循環(huán)。瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。    1.5Western印跡檢測

12、0;   PBS沖洗細(xì)胞一次，用含蛋白酶抑制劑的冷NP-40細(xì)胞裂解液收獲蛋白。將抽提蛋白用Bradford法定量，50g/泳道進(jìn)行SDS-PAGE；電泳結(jié)束后，以100V，1h將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；封閉液（含0.5%脫脂奶粉)封閉2h，加入一抗(1400,V/V)4過夜，二抗(11500，V/V)室溫下雜交45min，洗膜后用ECL試劑盒進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，壓片、顯影、定影，觀察蛋白印跡。    1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖    細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24、48、72h；在以上時段分別加入MTT，測其

13、A490值,具體方法見文獻(xiàn)6。分別設(shè)未作任何處理的空白組、空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、SODN組、ASODN組；同時將ODN終濃度分別設(shè)為200、400、600nmol/L。每組均設(shè)8個平行孔(取平均值作為1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果),并重復(fù)3次(批)實(shí)驗(yàn)。反義寡核苷酸對細(xì)胞生長的抑制率=(A反義核酸-A對照)/A對照×100%。于酶標(biāo)免疫測定儀上測定。    1.7反義寡核苷酸與高三尖杉酯堿共同處理細(xì)胞    在6孔板內(nèi)放置預(yù)先處理好的蓋玻片，按適當(dāng)?shù)募?xì)胞數(shù)接種。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到適當(dāng)生長密度時轉(zhuǎn)染寡核苷酸，ODN終濃度為400nmol/L。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染6h

14、后,換為含0.2mg/L濃度的高三尖杉酯堿的RPMI 1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定。    1.8細(xì)胞凋亡檢測    用DNA片段原位末端標(biāo)記(TUNEL)法，檢測經(jīng)反義寡核苷酸（400nmol/L）與高三尖杉酯堿（0.2mg/L）共同處理的細(xì)胞，與對照組細(xì)胞(無義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后，0.2mg/L濃度高三尖杉酯堿處理)凋亡的比率。每組均設(shè)6個平行孔，并重復(fù)1次。    1.9統(tǒng)計學(xué)處理    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0統(tǒng)

15、計軟件行t檢驗(yàn)和方差分析。    2結(jié)果    2.1ASODN對A549細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)的影響RT-PCR檢測結(jié)果顯示,各組細(xì)胞均有不同程度特異性Survivin擴(kuò)增產(chǎn)物條帶（347bp），但ASODN組表達(dá)均顯著弱于SODN對照組和空白對照組(圖1)。-actin內(nèi)對照產(chǎn)物（183bp）量均一致，表明該序列Survivin的ASODN可誘導(dǎo)survivin mRNA特異性的降解。    1泳道為ASODN組，2泳道為SODN組，3泳道為空白對照組   

16、圖1RTPCR檢測ASODN對細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)的影響    Fig.1Antisense oligonucleotides downregulates the expression of mRNA survivin    2.2ASODN對A549細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞均有特異性Survivin蛋白(16.5KD)條帶，但ASODN組蛋白表達(dá)均明顯弱于SODN對照組和空白對照組(圖2)，表明該序列ASODN能降低A549細(xì)胞內(nèi)Survivin蛋白的表達(dá)。

17、60;   1泳道為ASODN組，2泳道為SODN組，3泳道為空白對照組    圖2Western blot檢測ASODN對細(xì)胞Survivin蛋白表達(dá)的影響    Fig.2ASODN decrease the expression of survivin protein    2.3ASODN對A549細(xì)胞增殖的影響    在轉(zhuǎn)染48h后,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度Survivin的ASODN與相對應(yīng)的空白組、空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、SODN組相比，對SMMC-77

18、21細(xì)胞的生長有明顯抑制作用（ASODN組與各組相比較，P0.01）；400nmol/L濃度的ASODN抑制率（40.23±2.64%）明顯高于200nmol/L組（26.73±1.78%）（0.01），而與600nmol/L組（41.04±2.92%）沒有明顯差異（0.05）；（圖3）?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的生長有較小的抑制(4.17±0.23%)，可能是脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性。    圖3Survivin反義寡核苷酸對A549細(xì)胞增殖的抑制    Fig.3Antisense oligonu

19、cleotides inhibit the proliferation of A549 cells    2.4ASODN對高三尖杉酯堿誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的影響TUNEL法檢測ASODN和高三尖杉酯堿共同處理的細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)ASODN對高三尖杉酯堿誘導(dǎo)SMMC-7 721細(xì)胞凋亡有顯著作用，ASDON組的凋亡率（31.85±4.56%）明顯高于對照組(16.14±2.12%)（0.01），顯示ASODN提高了細(xì)胞對高三尖杉酯堿的敏感性（圖4）。    圖4ASODN和高三尖杉酯堿共同誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡率&#

20、160;   Fig.4Apoptotic rate of A549 cells induced by ASODN and HHT    3討論    IAP家族是一類進(jìn)化過程中高度保守的凋亡抑制蛋白,在體外能夠直接抑制細(xì)胞凋亡下游終端效應(yīng)器Caspase-3和Caspase-7。與IAP家族的其它蛋白不同，Survivin對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分裂周期具有雙重調(diào)控作用。用免疫組化法檢測60個腫瘤細(xì)胞株的Survivin水平,發(fā)現(xiàn)均有不同程度表達(dá)。這一普遍分布現(xiàn)象顯示Survivin基因在癌癥中可能處于失控的表達(dá)狀態(tài)。S

21、urvivin的組織分布特征具有明顯的細(xì)胞選擇性，除胎盤和胸腺組織中有微弱的表達(dá)外，在其它正常組織中都檢測不到，而Survivin在胚胎發(fā)育時期曾廣泛分布于不同的胚胎組織，表明Survivin基因的表達(dá)在人類發(fā)育過程中起著某些重要的作用7。Survivin在絕大多數(shù)腫瘤組織以及約50%高分化的非霍奇金氏淋巴瘤中表達(dá)，且其高表達(dá)常與預(yù)后不良相關(guān)。    Survivin在許多腫瘤表達(dá)的普遍性，使得應(yīng)用Survivin的阻斷性抗體免疫治療或基因治療促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤療法成為可能。第一，Survivin在多數(shù)腫瘤中高表達(dá)或普遍表達(dá)，而在相應(yīng)正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)

22、，使靶向治療具有較好的特異性；第二，Survivin在細(xì)胞中呈周期依賴性表達(dá)，靶向治療能在周期中相應(yīng)的階段增加化療、放療的藥敏性,促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡。目前,國內(nèi)外已有多篇報道證實(shí),用反義寡核苷酸影響Survivin基因的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并誘發(fā)凋亡。    本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用軟件對人Survivin mRNA的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬，依此設(shè)計并合成了反義寡核苷酸ASODN鏈，RT-PCR和Western印跡結(jié)果顯示，該Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)Survivin的mRNA及蛋白水平均有顯著下降,作為對照的反義寡核苷酸序列則不能降低細(xì)胞內(nèi)Survivin

23、的表達(dá)。同時MTT實(shí)驗(yàn)顯示survivin反義寡核苷酸能有效抑制A549細(xì)胞的增殖，抑制率明顯高于無義寡核苷酸和空白質(zhì)粒組。說明在降低細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的增殖能力被有效抑制，提示以Survivin基因?yàn)槟繕?biāo)的靶向治療是可行的。    高三尖杉酯堿(Homoharringtonine,HHT)是從中國特有的三尖杉植物中分離出的生物堿，可干擾核蛋白體功能，通過使核蛋白體分解，釋放出新生肽鏈來抑制蛋白合成的起始。已發(fā)現(xiàn)其可抑制多種腫瘤細(xì)胞生長增殖,誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡。目前高三尖杉酯堿已被列為抗腫瘤藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在相同濃度的高三尖杉酯堿下，反義

24、寡核苷酸轉(zhuǎn)染的細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組細(xì)胞。說明細(xì)胞Survivin基因的表達(dá)降低后，其抗凋亡的能力被有效的抑制了。Survivin反義核酸能加強(qiáng)HHT誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，其意義在于一方面能夠減少HHT的藥物臨床用量,減輕毒副作用;另一方面,又加強(qiáng)了治療作用,使它的應(yīng)用更加安全有效。    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Survivin靶向抑制可望應(yīng)用于某些Survivin高表達(dá)腫瘤的特異性治療?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Ambrosini G,Adida C,Altieri D.A Novel Antiapoptosisgene,Survivin,Expressed in Cancer and LymphomaJ.Nat Med,1997,3:917-921.2Suzuki A,Ito T,Kowano H,et al.Survivin Initiates Procaspase3/p21 Complex For- mation as a Result of Interaction with CDK4