V79和V798細(xì)胞周期及其調(diào)控因子的差異比較

1、    V79和V798細(xì)胞周期及其調(diào)控因子的差異比較*        摘要為了解V79和V79-8兩種細(xì)胞周期及調(diào)控因子的差異，用3H胸腺嘧啶核苷參入法檢測(cè)兩種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)V79細(xì)胞無可檢測(cè)到的G2期；V79-8細(xì)胞則同時(shí)缺乏可檢測(cè)到的G1和G2期。流式細(xì)胞光度術(shù)顯示，V79G1期細(xì)胞明顯多于V79-8，表明兩者在G1期調(diào)控上存在差異。比較兩者G1期周期調(diào)控因子的mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，V79-8cyclin D1,cyclin D3和Id表達(dá)水平明顯高于V79，這可能直接導(dǎo)致

2、了兩者G1的差異。關(guān)鍵詞V79細(xì)胞V79-8細(xì)胞細(xì)胞周期調(diào)控周期蛋白周期蛋白依賴激酶 V79和V79-8為兩種增殖速度非?？斓闹袊?guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞系(Chinese hamster lung fibroblast)，它們的倍增時(shí)間分別為12.5h和9.5h。V79最初由Ford和Yerganian于1958年建系，而V79-8是由Elkind和Sutton于1960年從母細(xì)胞系V79轉(zhuǎn)化而來。7080年代，用3H胸腺嘧啶核苷參入法證實(shí)，V79細(xì)胞無可檢測(cè)到的G2期；V79-8細(xì)胞則同時(shí)缺乏可檢測(cè)到的G1和G2期1，2，但并沒有對(duì)其細(xì)胞周期調(diào)控(cell cycle regulation)的分子

3、機(jī)制做更為深入的研究。我們利用現(xiàn)有的在細(xì)胞周期G1期中起關(guān)鍵作用的CDK、cyclin、Id等基因?yàn)樘结?，?duì)它們?cè)赩79、V79-8細(xì)胞的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，以期對(duì)其周期調(diào)控有更為深入的了解。我們的結(jié)果表明：V79-8細(xì)胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的RNA表達(dá)水平明顯高于V79細(xì)胞，這可能直接導(dǎo)致了這兩種細(xì)胞在G1期調(diào)控的差異。材料和方法1.細(xì)胞培養(yǎng)V79細(xì)胞由上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)提供，V79-8細(xì)胞由M D Anderson腫瘤中心Rao PN博士贈(zèng)送，均培養(yǎng)于DMEM(GIBCO BRL)培養(yǎng)基(10%小牛血清，105IU/L青霉素，100mg/L鏈霉素)，37，5%

4、CO2的孵育箱中。2.流式細(xì)胞光度術(shù)(FCM)細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用冰冷的PBS洗，然后在80%乙醇-20固定，12h后，樣品用冰冷的PBS洗3次，加入200mg/L無DNase的RNase，37保溫30min，之后加入1g/L的溴化丙啶(propidium iodide,PI Sigma公司)，37保溫30min，樣品4避光保存，并在24h內(nèi)測(cè)量3。3.Northern雜交(Northern bolotting)細(xì)胞總RNA用異硫氰酸胍一步法提取4，上樣量為15g，甲醛變性凝膠電泳后，真空轉(zhuǎn)移至尼龍膜上5，雜交所用探針為自制的體外轉(zhuǎn)錄-32PrUTP 標(biāo)記單鏈反義RNA(Promega,Tec

5、hnical Manual)，其載體、RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度如下：pGEM3z-actin-sp6-0.56kb;pSK-CDK4-T3-1.3kb;pGEM4z-CycD1-sp6-1.14kb;pXJ41-CycD3(antisense)-T7-1.96kb;pSK-Id-T7-0.93kb。結(jié)果細(xì)胞流式光度術(shù)的結(jié)果表明V79比V79-8的G1期細(xì)胞多了17%，這說明兩者在G1期的調(diào)控上存在明顯差別(1)。從Northern雜交的結(jié)果可以看出，V79-8細(xì)胞中cyclin D1、cyclin D3和Id的mRNA表達(dá)水平明顯高于V79細(xì)胞，而CDK4的表達(dá)無明顯差別。這些基因高水平的表達(dá)

6、可能造成V79-8細(xì)胞中DNA合成在M期結(jié)束后馬上開始，從而使細(xì)胞增殖速度加快，細(xì)胞始終處于快速增殖的狀態(tài)，在周期時(shí)相上表現(xiàn)為G1期縮短以至難以檢測(cè)(2)。     1V79和V79-8細(xì)胞的流式細(xì)胞光度術(shù)曲線Fig.1 FCM curves of V79 and V79-8cellsA:V79； B：V79-8     2V79和V79-8細(xì)胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4、Id基因的Northern雜交分析RNA探針：1.cyclin D1 2.cyclin D3 3.CDK4 4.Id a

7、.V79b.V79-8Fig.2 Northern blotting analysis of cyclinD1,cyclinD3,CDK4,Id genes expression in V79 and V79-8 cellsRiboprobes:1.cyclin D1; 2.cyclinD3; 3.CDK4; 4.Id a.V79； b.V79-8討論由于3H胸腺嘧啶核苷參入法和流式細(xì)胞光度術(shù)方法上的差異，使得兩者在細(xì)胞周期分析時(shí)可以得到不同的結(jié)果。前者以是否標(biāo)記上H3胸腺嘧啶核苷來劃分是否屬于S期，而后者是以DNA的含量來給細(xì)胞分期的，如果細(xì)胞只有極少量的DNA合成，那么用前一方法應(yīng)歸為S期

8、，用后一方法則歸為G1期。但用流式光度術(shù)測(cè)得V79-8細(xì)胞有G1期，而同時(shí)也測(cè)量V79細(xì)胞的G1期，這樣就可以比較兩者G1期的差異，結(jié)果是V79G1期的細(xì)胞多于V79-8，結(jié)合以往3H胸腺嘧啶核苷參入的結(jié)果1，2，說明M期結(jié)束后V79-8較V79更快進(jìn)入S期開始DNA的合成。另外，PCC(premature chromasome condensation)的結(jié)果也表明V79-8細(xì)胞存在G1期6，7。這兩種細(xì)胞G1期的差異為研究G1期的調(diào)控提供了很好的模型。同時(shí)，V79-8細(xì)胞周期的特殊性也使其成為細(xì)胞周期調(diào)控研究的極好模型，我們用反義的G1期調(diào)控因子CDK4、cyclin D3以及正義的p21

9、Cip1轉(zhuǎn)染V79-8細(xì)胞，都使其出現(xiàn)了明顯的G1期，而用反義的cyclin B1轉(zhuǎn)染V79-8細(xì)胞則出現(xiàn)了明顯的G2期(將陸續(xù)發(fā)表)。cyclin D1、D3為G1期cyclin，它們可以與CDK2、4、5結(jié)合，形成激酶復(fù)合物8，促進(jìn)G1/S的轉(zhuǎn)換。兩者高水平的表達(dá)，使上述激酶活性提高，磷酸化下游底物，例如Rb蛋白磷酸化后可釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F-1，促進(jìn)DNA復(fù)制起始物的合成，加快向S期的轉(zhuǎn)換。Id基因?yàn)榉只种苹?，具有抑制分化、促進(jìn)增殖的作用，也是G1期的調(diào)控因子。在肌肉細(xì)胞中，Id基因的表達(dá)可以拮抗肌源性b-HLH調(diào)節(jié)因子(如MyoD)的作用，以達(dá)到抑制肌肉細(xì)胞分化的作用，說明Id

10、基因在成纖維細(xì)胞的分化與增殖中起一定的作用，V79-8細(xì)胞中Id的高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞G1/S的轉(zhuǎn)換，加快細(xì)胞周期的運(yùn)轉(zhuǎn)9。另外，我們以往的研究發(fā)現(xiàn)反義Id基因可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，這從反面證實(shí)了Id的生長(zhǎng)促進(jìn)作用10。Rao等6發(fā)現(xiàn)V79-8細(xì)胞中，DNA合成誘導(dǎo)物質(zhì)水平在整個(gè)周期中保持不變，M期也保持較高水平，這樣在進(jìn)入下一輪周期時(shí)為起始DNA合成的準(zhǔn)備期G1期就大大地縮短，甚至檢測(cè)不出。從以上結(jié)果可以推測(cè)這些誘導(dǎo)物質(zhì)就是推動(dòng)G1/S轉(zhuǎn)換的調(diào)控因子，其中就包括cyclin D1、cyclin D3和Id。收稿1997-03修回1997-05參考文獻(xiàn)1Liskay B M.Absence of

11、a measurable G2 phase in two Chinese hamster cell lines.Proc Natl Aca Sci USA,1977,74(4):16222Liskay B M.Most of the G1 period in hamster cells is eliminated by lengthening the S period.Proc Natl Aca Sci USA,1981,78(10):62953Tounekti O,Belehradek J Jr,Mir L M.Relationship between DNA fragment,chroma

12、some condensation,and changes in folw cytometry profiles detected during apoptosis,Experimental Cell Research,1995,217(2):5064Chomezynski P,Sacchi N.Singlestep RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Analytical Biochemistry,1987,167(2):1565Sambrook J,Fritsch E F, Man

13、iatis T.Molecular Cloning-A Laboratory Manual.2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:7.43-7.456Rao P N,Wilson B A,Sunkara P S.Inducers of DNA synthesis present during mitosis mammalian cells lacking G1 and G2 phases.Proc Natl Aca Sci USA,1978,75(10):50437王永潮，梁弗佑，王端順，等.taxol對(duì)V79-8系

14、細(xì)胞微核化機(jī)理的探討.北京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1990，27(2)：2378Xiong Y,Zhang H,Beach D.D Type cyclins associate with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA.Cell,1992,71(4):5059馮潔，王永潮.分化抑制因子(Id)的研究進(jìn)展.生理科學(xué)進(jìn)展，1997，28(2)：13910王永潮，朱兆文，陳德高等.反義Id基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后TGF-,mRNA表達(dá)的研究.解剖學(xué)報(bào)，1996，27(4)：345DIFFEREN

15、TIAL CELL CYCLE REGULATION BETWEEN V79 AND V79-8 CELLSJiang Hong,Feng Jie,WangYongchao(The Key Laboratory of Cell Proliferation and Regulation Biology,Beijing Normal University,Beijing)V79 and V79-8 are two Chinese hamster lung fibroblast cell lines which proliferate very rapidly.It is verified thro

16、ugh 3H thymidine incorporation assay that V79 cells have non-detectable G2 phase and V79-8 cells have neither G1 nor G2 phase.With flow cytometry,we found that V79 had obviously more G1 phase cells than V79-8 ,which indicates that they are different in G1 phase regulation.Comparing the mRNA expression levels of several regulators in G1 phase,we also found that the expression levels of cyclin D1,D3 and Id in V79-8 cells was obviously higher than that in V79 cells.This might cause