MTEC1分泌的趨化因子引起特定亞群胸腺細(xì)胞的定向遷移

1、    MTEC1分泌的趨化因子引起特定 亞群胸腺細(xì)胞的定向遷移        【 摘要 】目的分析胸腺髓質(zhì)上皮樣細(xì)胞系MTEC1分泌的化學(xué)趨化因子對胸腺細(xì)胞亞群的趨化作用。 方法以抗體加補(bǔ)體殺傷結(jié)合免疫磁珠及panning法，將小鼠胸腺細(xì)胞分離純化8SP)四亞群細(xì)胞，用Boyden小室分析MTEC1-SN對四群胸腺細(xì)胞的趨化作用。 結(jié)果MTEC1-SN對DP及CD4SP胸腺細(xì)胞有趨化活性(CI=6.6±1.0及6.1±1.8)；對CD8SP細(xì)胞

2、有中度趨化活性(CI=3.2±1.0)；對DN趨化活性微弱(CI=1.3±0.6)。化學(xué)趨化因子MCP-1純品對CD4SP胸腺細(xì)胞顯示強(qiáng)趨化活性(CI=5.6)，對DN胸腺細(xì)胞則無可測出趨化活性。 結(jié)論MTEC1分泌的化學(xué)趨化因子對DP，CD4SP及CD8SP胸腺細(xì)胞有顯著趨化作用，對DN胸腺細(xì)胞幾乎無趨化作用。提示此類化學(xué)趨化因子有趨使胸腺發(fā)育中后期階段的細(xì)胞向胸腺髓質(zhì)區(qū)遷移和定位的作用?！?主題詞 】趨化因子胸腺基質(zhì)細(xì)胞胸腺細(xì)胞細(xì)胞遷移 Oriented migration of certain subsets of thymocytes induced by chem

3、okines produced by MTEC1 cells Liu Zhugong,Chen Weifeng. Department of Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083【 Abstract 】ObjectiveTo study the effect of chemotactic activity of mouse medullary-type epithelial cell line MTEC1 secreted chemokines on thymocyte subsets. MethodsBased on the

4、 distinct expression of CD4 and /or CD8 molecules,four major subsets of CD4+CD8+(DP)，CD4-CD8-(DN)，CD4+CD8-(SP) and CD4-CD8+(SP) mouse thymocytes were isolated by the combination of antibody plus complement killing,immunobeads and panning separation.The chemotaxis of MTEC1 secreted chemokines(in SN)t

5、o four thymocyte subsets was assessed in Boyden Chamber and the chemotactic activity was quantitatively determined. ResultsMTEC1-SN was a strong chemoattractant to DP and CD4SP with CI=6.6±1.0 and 6.1±1.8, repectively,and showed an intermidiate activity to CD8SP(CI=3.2±1.0), by contra

6、st,MTEC1-SN had very weak chemotactic activity to DN thymocytes(CI=1.3±0.6). To confirm those results,purified MCP-1, a major chemokine that MTEC1-SN contains,exhibited strong chemotactic activity to CD4SP thymocytes(CI=5.6), but no detectable activity to DN thymocytes. ConclusionsMouse thymic

7、medullary-type epithelial cell line(MTEC1) could secret chemokines,which were chemoattractant to DP, CD4SP and CD8SP thymocytes,but not to the DN thymocytes.It implies that MTEC1 secreted chemokines may chemotactically attract the intermidiate (DP) and late(SP) stages of developing thymocytes to mig

8、rate directly and retain in thymic medulla.【 Subject words 】Chemotactic factorsThymic stromal cellThymocyteCell migrationT細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育的前提是，來源于骨髓或胎肝的pro-T細(xì)胞必須定向遷移進(jìn)入胸腺，才能發(fā)育成為表型和功能成熟的T細(xì)胞。胸腺內(nèi)的細(xì)胞發(fā)育成熟過程，也伴隨著胸腺細(xì)胞從胸腺皮質(zhì)向髓質(zhì)定向遷移。目前對兩種遷移現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，一般認(rèn)為具有化學(xué)趨化活性因子(chemotactic factor)發(fā)揮著關(guān)鍵作用,但是何種分子及如何發(fā)揮作用尚未闡明。趨化因子(Ch

9、emokines)超家族是近年被發(fā)現(xiàn)的一大類介導(dǎo)白細(xì)胞遷移、活化的新型因子，目前發(fā)現(xiàn)的成員已有30個(1，分為C-X-C()亞家族和C-C()亞家族。C-X-C亞家族的因子主要對中性粒細(xì)胞發(fā)揮趨化作用，而C-C亞家族因子的主要靶細(xì)胞是單核巨噬細(xì)胞。兩亞家族中均有一些因子如IL-8、IP-10、MCP-1、MIP-1和RANTES等對淋巴細(xì)胞有趨化作用。我們觀察到多株小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系能分泌趨化因子2。為探討趨化因子對T細(xì)胞發(fā)育中細(xì)胞定向遷移的可能作用，我們進(jìn)一步分析了MTEC1分泌的趨化因子，證明能選擇性地吸引特定亞群胸腺細(xì)胞定向遷移。胸腺中趨化因子作用的研究能進(jìn)一步揭示T細(xì)胞發(fā)育中的定向遷移

10、機(jī)制，并有可能發(fā)現(xiàn)新型趨化因子。材料與方法1.實驗動物：46周齡的BALB/c純系小鼠，雌雄均可，由本校實驗動物部提供。2.細(xì)胞因子和單克隆抗體：rhIL-8由Larrack博士惠贈，分子量為7.5×103 MCP-1由Van Damme教授惠贈?？剐∈驝D4分子的雜交瘤細(xì)胞株GK1.5和RL172，經(jīng)注射裸鼠腹腔，分別產(chǎn)生IgG型和IgM型抗CD4的抗體；抗小鼠CD8分子的雜交瘤細(xì)胞株536和3.155，經(jīng)注射裸鼠腹腔，分別產(chǎn)生IgG型和IgM型抗CD8的抗體。四種抗體經(jīng)效價滴定和除菌后，凍存?zhèn)溆??？剐∈驝D3雜交瘤145-2C11培養(yǎng)后收獲上清，凍存?zhèn)溆?。FITC標(biāo)記羊抗大鼠Ig

11、G購自Sigma公司。FITC標(biāo)記的抗小鼠CD8的抗體，及PE標(biāo)記的抗小鼠CD4的抗體，購自Pharmingin公司。3.細(xì)胞系：MTEC1為小鼠胸腺上皮細(xì)胞系，細(xì)胞系的建立、鑒定和維持參見文獻(xiàn)3。THP-1是腫瘤性單核細(xì)胞系，用于單核細(xì)胞趨化實驗，購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。4.抗體包被磁珠：羊抗大鼠IgG包被DynabeadsR M450及相應(yīng)器材購自Dynal公司。5.補(bǔ)體：取自成年豚鼠(400500g/只)血清，經(jīng)BALB/c小鼠胸腺、脾、肝細(xì)胞吸收，進(jìn)行補(bǔ)體殺傷實驗滴定效價，分裝后-70冷凍保存。6.趨化小室、濾膜及配套器械：48孔趨化小室(26l/孔)，3m孔徑的硝酸纖維素膜，

12、5m孔徑PVP-free Polycarbonate膜，5m孔徑的Standard Polycarbonate膜及相應(yīng)配套器材均購于Neuro Probe公司。7.培養(yǎng)基及緩沖液：DMEM (Gibco)配成含10% FCS (Gibco)和5×10-5mol/L 2-ME的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)胸腺基質(zhì)細(xì)胞。含10% FCS的RPMI 1640 (Gibco)用于淋巴細(xì)胞及應(yīng)答細(xì)胞系的短期培養(yǎng)；不含2-ME的2% NCS-RPMI 1640及含5% NCS的平衡鹽溶液BSS用于殺傷實驗及細(xì)胞亞群分離；無血清培基添加劑為德國寶靈曼公司產(chǎn)品。內(nèi)含0.1% NaN3的5% NCS-BSS用于細(xì)

13、胞熒光染色。pH9.6, 0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，或pH9.6, 0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液用于panning法中的抗體包被。低滲的NH4Cl溶液用于溶解小鼠紅細(xì)胞。聚蔗糖和泛影葡胺配成比重1.090的分層液，用于分離小鼠單個核細(xì)胞。PBS等溶液按常規(guī)方法配制。8.胸腺基質(zhì)細(xì)胞系MTEC1培養(yǎng)上清的制備：MTEC1細(xì)胞系按2.5×104/ml起始，用10% FCS-DME培養(yǎng)于37，5% CO2溫箱中2日，用BSS液洗3次后，換用含1%無血清添加劑的DME培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，收集上清，過濾分裝，-20凍存?zhèn)溆谩?.胸腺細(xì)胞亞群的分離及趨化實驗CD4-C

14、D8-(DN)胸腺細(xì)胞的分離：胸腺單個核細(xì)胞懸液中分別加入抗CD4(RL172)、抗CD8(3.155)的單克隆抗體，4孵育45分鐘后，再加入適當(dāng)濃度的補(bǔ)體，37，保溫30分鐘。用比重1.090的分層液進(jìn)行密度梯度離心，分離獲得活細(xì)胞。細(xì)胞調(diào)整到適當(dāng)濃度后重復(fù)上述步驟一次。分離出的活細(xì)胞與抗CD4(GK1.5)抗CD8(536)的單克隆抗體共育30分種，離心洗去游離抗體，按Dynabeads靶細(xì)胞=201將免疫磁珠與細(xì)胞混合，4，作用1小時。孵育時應(yīng)注意經(jīng)常振蕩，以防止磁珠由于比重大發(fā)生沉降，而不能與靶細(xì)胞有效地進(jìn)行接觸。在孵育結(jié)束，開始分離之前，將細(xì)胞懸液稀釋，以防大量磁珠被吸向強(qiáng)磁場時裹帶

15、未結(jié)合磁珠的游離細(xì)胞，而降低回收率。用磁性分離器(BioMag Separator,Advanced Magnetic Inc.)吸附與磁珠結(jié)合的細(xì)胞而獲得游離細(xì)胞。經(jīng)抗CD4、CD8熒光單克隆抗體染色，F(xiàn)ACScan分析細(xì)胞純度。CD4+CD8-(SP)胸腺細(xì)胞的分離：胸腺單個核細(xì)胞懸液中加入抗CD8(3.155)的抗體，同上法進(jìn)行兩次細(xì)胞殺傷后，經(jīng)分層獲得未被殺傷的活細(xì)胞?？笴D4(GK1.5)的單抗腹水用包被液以1100稀釋后，包被Maxisorp聚苯乙烯培養(yǎng)盤(Nunc公司，145×20mm),37，2小時。用含5% NCS的PBS洗3次后，加入上述殺傷后細(xì)胞，4，作用40分

16、鐘。棄去不貼壁細(xì)胞，并以5% NCS-PBS洗10次，至顯微鏡下觀察無懸浮細(xì)胞。沖下貼壁細(xì)胞，熒光標(biāo)記抗CD4、抗CD8的抗體染色后分析細(xì)胞純度。CD4-CD8+(SP)胸腺細(xì)胞的分離：方法大致同上。用抗CD4(RL172)的單抗腹水替代GK1.5進(jìn)行細(xì)胞殺傷，用抗CD8的抗體3.155進(jìn)行細(xì)胞貼壁，獲得CD8SP細(xì)胞。CD4+CD8+(DP)胸腺細(xì)胞的分離：首先用抗CD4的抗體GK1.5進(jìn)行貼壁篩選(panning),獲得CD4SP及DP細(xì)胞，再次用抗CD8的抗體3.155進(jìn)行panning，不貼壁的CD4SP細(xì)胞被去除，從而獲得DP細(xì)胞，熒光抗體染色后檢查細(xì)胞純度。10.趨化試驗：參照文獻(xiàn)

17、4的方法，加以改進(jìn)，檢測MTEC1-SN對胸腺細(xì)胞的趨化活性。48孔趨化小室下室每孔放27l待測樣品，上室每孔放濃度為107/ml或5×106/ml的各類胸腺細(xì)胞懸液50l，中間隔以5m孔徑PVP-free Polycarbonate膜，37，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育結(jié)束后，將膜取出，刮去膜上表面沉降的細(xì)胞，保留定向遷移至下表面的細(xì)胞，甲醇固定，Gimsa染色20分鐘，用樹脂封片。每孔隨機(jī)取五個視野，于高倍鏡下計數(shù)的細(xì)胞數(shù)目，趨化指數(shù)(Chemotactic Index,CI)的計算方法如下：結(jié)果1.MTEC1-SN對全胸腺細(xì)胞顯示趨化作用：無菌取小鼠胸腺，仔細(xì)剝離血管和

18、被膜，研磨成單個細(xì)胞懸液，去除死細(xì)胞后，用于趨化實驗，經(jīng)預(yù)實驗，確定細(xì)胞濃度為107/ml。經(jīng)計算趨化指數(shù)CI為2.1±1.6(n=3)，說明MTEC1分泌的趨化因子對胸腺細(xì)胞有趨化作用。2.MTEC1-SN對CD4SP和DP胸腺細(xì)胞亞群有強(qiáng)烈的趨化作用：新鮮的小鼠胸腺細(xì)胞，首先經(jīng)IgM型抗CD8的抗體+補(bǔ)體兩次殺傷，96%的CD8陽性細(xì)胞被殺死，存留的細(xì)胞為CD4SP細(xì)胞和DN細(xì)胞，再用panning法分離CD4SP細(xì)胞。panning法分離細(xì)胞的原理與ELISA類似，在堿性條件下使CD4 McAb結(jié)合塑料平皿，洗去未吸附抗體，將分離的細(xì)胞放入平皿中共育，表達(dá)CD4分子的細(xì)胞與平皿

19、結(jié)合，經(jīng)充分清洗后，結(jié)合于平皿的CD4SP細(xì)胞得到回收，細(xì)胞純度98%(附，D)。經(jīng)抗CD4和抗CD8的抗體依次panning，可選擇CD4+CD8+DP細(xì)胞，純度為90%(附，F(xiàn))。經(jīng)預(yù)實驗，確定胸腺細(xì)胞的濃度為5×106/ml，趨化時間為4小時，孔徑5m的濾膜對胸腺細(xì)胞大小合適。趨化實驗結(jié)果：MTEC1對CD4SP細(xì)胞、DP細(xì)胞均表現(xiàn)趨化活性，趨化指數(shù)CI分別為6.6±1.1和6.1±1.8(n=3)。3.MTEC1-SN對CD8SP胸腺細(xì)胞有中等強(qiáng)度的趨化活性：CD8SP細(xì)胞的分離方法類似，先用補(bǔ)體殺傷法去除CD4陽性細(xì)胞，再用panning法選擇CD8SP

20、細(xì)胞，CD8SP細(xì)胞純度為83%(附，E)，活細(xì)胞95%，MTEC1對CD8SP細(xì)胞表現(xiàn)趨化活性，趨化指數(shù)CI為3.2±1.0(n=3)。4.MTEC1對DN胸腺細(xì)胞只有微弱的趨化活性：胸腺細(xì)胞用IgM型抗CD4和抗CD8的抗體+補(bǔ)體經(jīng)一次殺傷，DN純化可達(dá)90%，二次殺傷后，細(xì)胞濃度為95%。這時結(jié)合應(yīng)用免疫磁珠分離方法，殘存的CD4或CD8陽性細(xì)胞與相應(yīng)IgG型抗體結(jié)合后，用磁性分離器將與磁珠結(jié)合的細(xì)胞和不與磁珠結(jié)合的細(xì)胞分離。選擇不與磁珠結(jié)合的細(xì)胞，即DN細(xì)胞，F(xiàn)ACS分析純度98%(附，C)，活細(xì)胞95%。MTEC1-SN對DN細(xì)胞的 趨化作用則很微弱，CI=1.3±

21、;0.6(n=3)。5.純品7.5×103MCP-1對DN胸腺細(xì)胞和CD4SP胸腺細(xì)胞的作用：檢測7.5×103 MCP-1(2nmol/L)對CD4-CD8-和CD4+CD8-胸腺細(xì)胞的趨化作用，MCP-1對CD4-CD8-細(xì)胞無可測出趨化活性，對CD4+CD8-細(xì)胞有較顯著的趨化活性，趨化指數(shù)為5.6(n=2)。討論本室在T細(xì)胞發(fā)育的研究中，建立了多個小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系，已發(fā)現(xiàn)MTEC系可自發(fā)分泌多種類型細(xì)胞因子，包括IL-1，IL6，IL-7，IFN等等。我們近來證明建株的胸腺基質(zhì)細(xì)胞系還可自發(fā)分泌化學(xué)趨化因子，為闡明趨化因子的類型、數(shù)目和作用特點，我們已經(jīng)較全面地分

22、析了趨化因子對多種靶細(xì)胞的趨化作用2。胸腺基質(zhì)細(xì)胞系分泌趨化因子的證明，可能為胸腺細(xì)胞的定向遷移提供合理解釋。附胸腺細(xì)胞亞群分離純化結(jié)果Fig. Purified subsets of thymocytesA.Normal negative control of thymocytes B.Normal thymocytes stained by anti-CD4 and anti-CD8 antibodiesC.Purified CD4-CD8-thymocytesD.Purified CD4+CD8-thymocytesE.Purified CD4-CD8+thymocytesF.Purif

23、ied CD4+CD8+thymocytes在哺乳動物，骨髓是造血干細(xì)胞的主要來源，pro-T細(xì)胞從骨髓進(jìn)入胸腺，經(jīng)歷胸腺微環(huán)境的選擇，發(fā)育為成熟的功能性T細(xì)胞后遷出胸腺，定位于外周淋巴器官如淋巴結(jié)胸腺依賴區(qū)而發(fā)揮免疫效應(yīng)。從骨髓胸腺外周伴隨著一系列的細(xì)胞定向遷移，這是T細(xì)胞分化發(fā)育和功能發(fā)揮所必須的。目前，對pro-T細(xì)胞由骨髓進(jìn)入胸腺的機(jī)制研究較多。一般認(rèn)為。pro-T細(xì)胞從骨髓遷出，通過血液循環(huán)而到達(dá)胸腺，在化學(xué)趨化活性細(xì)胞因子的作用下，pro-T細(xì)胞定向遷入胸腺內(nèi)，繼而能與胸腺微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞相互作用，開始復(fù)雜的分化發(fā)育過程5。經(jīng)多年研究，雖有很多作者發(fā)現(xiàn)了有此作用的不同分子量的因子，

24、但多未能確定是何分子6。從大鼠胸腺上皮細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)的2-微球蛋白(2m)7，經(jīng)轉(zhuǎn)基因動物證明，2m不是pro-T細(xì)胞遷入胸腺所必須的8。因此，已有作者把目光放在了最近幾年發(fā)現(xiàn)的對T細(xì)胞有趨化作用的趨化因子(Chemokines)上，認(rèn)為應(yīng)詳細(xì)分析不同基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子的種類和作用，提出MCP-1是一個可能的候選者9。相對于pro-T向胸腺定向遷移的研究，我們對胸腺細(xì)胞隨發(fā)育而在胸腺內(nèi)遷移的機(jī)制知之甚少。大致過程為隨著胸腺細(xì)胞的成熟，胸腺細(xì)胞逐漸由皮質(zhì)向髓質(zhì)遷移，髓質(zhì)內(nèi)成熟的細(xì)胞最終遷出胸腺進(jìn)入外周。MTEC1細(xì)胞能產(chǎn)生高水平的趨化因子，其中之一已證明為亞家族趨化因子MCP-110。本實驗中，我

25、們首先用未經(jīng)分離的全胸腺細(xì)胞作為靶細(xì)胞，經(jīng)檢測，MTEC1細(xì)胞的培養(yǎng)上清對小鼠胸腺細(xì)胞表現(xiàn)趨化作用，但強(qiáng)度較弱，組間差異也較大。MTEC1細(xì)胞經(jīng)鑒定為髓質(zhì)型的胸腺上皮細(xì)胞系，其高水平的趨化因子產(chǎn)生和對胸腺細(xì)胞的趨化作用，使我們猜測其在胸腺細(xì)胞由皮質(zhì)區(qū)向髓質(zhì)區(qū)的遷移中發(fā)揮作用。為此我們分離純化了四個主要的胸腺細(xì)胞亞群，單獨分析各亞群的遷移能力，得到的結(jié)果為，MTEC1-SP對DN細(xì)胞作用微弱，而對DP亞群及兩個SP亞群作用較強(qiáng)。分析以上結(jié)果，可以看到，在胸腺細(xì)胞的四個重要亞群中，DP和SP都是較DN更為成熟的胸腺細(xì)胞，DP是位于胸腺皮質(zhì)和皮髓交界處準(zhǔn)備進(jìn)入髓質(zhì)而進(jìn)一步發(fā)育的主要亞群，在緊靠髓質(zhì)的

26、皮髓交界處存在一定比例的SP細(xì)胞，MTEC1-SN對SP和DP細(xì)胞的強(qiáng)烈趨化活性由此可以推斷，胸腺髓質(zhì)區(qū)的基質(zhì)細(xì)胞分泌趨化因子，吸引發(fā)育逐漸成熟的細(xì)胞進(jìn)入髓質(zhì)區(qū)。產(chǎn)品MCP-1的 實驗結(jié)果，以及MTEC1-SN對CD4+的胸腺細(xì)胞系EL-4的強(qiáng)烈趨化作用，也支持了這一觀點(結(jié)果另文發(fā)表)。由此，可看到胸腺內(nèi)細(xì)胞定向遷移有大致輪廓：髓質(zhì)的基質(zhì)細(xì)胞能分泌一定類型的趨化因子，特定作用于發(fā)育逐漸成熟的亞群，處于隨發(fā)育進(jìn)程而向髓質(zhì)遷移；未能進(jìn)一步發(fā)育的較幼稚的亞群，遷移能力很弱，在原位經(jīng)凋亡等機(jī)制而大量死亡。MTEC1-SN對DN細(xì)胞的微弱趨化作用，提示此群細(xì)胞的遷移可能受其他類型胸腺基質(zhì)細(xì)胞分泌的趨化

27、因子的作用。MTEC1分泌的多種趨化因子中，目前只確認(rèn)了MCP-1，因而亦不能排除尚未確定的某種趨化因子對特定亞群的趨化作用。我們將進(jìn)行更詳盡的分析。 本課題受國家自然科學(xué)基金資助(編號：39730410)作者單位：100083 北京醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系 衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)免疫學(xué)重點實驗室參考文獻(xiàn)1Zlotnik A,Daine B,Smith CA.Activation of an interleukin-1 responsive T cell lymphoma by fixed P388D1 macroph-ages and an antibody against the Ag:MHT T cell receptor.Cell Immunol,1985,94447-449.2劉祝公，房蕾，陳慰峰.小鼠胸腺基質(zhì)細(xì)胞系分泌的趨化因子的分析.實驗生物學(xué)報，1996，2925-38.3陳慰峰，袁潤英，孫其嶺，等.小鼠胸腺上皮細(xì)胞株的建立及其鑒定.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1990，10366-369.4Pilaro AM,Sayers TJ,McCormick KL,et al.Animproved in vitro assay to qua