兔抗人CD1d分子α3結(jié)構(gòu)域抗體的制備與鑒定

1、兔抗人CD1d分子3結(jié)構(gòu)域抗體的制備與鑒定                      作者：陳章權(quán), 黃震, 梁曉東, 何天文, 陸田田 【摘要】  目的: 制備兔抗人CD1d分子3結(jié)構(gòu)域（hCD1d?3）多克隆抗體。方法: PCR法擴(kuò)增出人hCD1d?3編碼區(qū)基因, 將其克隆入原核表達(dá)載體pET28中, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）, 用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá), 用Ni

2、2+?NTA Agarose親和層析法純化重組蛋白, 以之為免疫原免疫家兔, 制備多克隆抗體, 并用ELISA、 Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測抗體。結(jié)果: 成功構(gòu)建了hCD1d?3原核表達(dá)載體pET28/hCD1d?3, 高效表達(dá)并純化hCD1d?3蛋白, 間接ELISA檢測所制備抗體的效價(jià)為16400, Western blot顯示該抗體能與hCD1d特異結(jié)合, 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果表明該抗體識別人小腸組織中的天然hCD1d。結(jié)論: 通過制備重組hCD1d?3蛋白為免疫原, 免疫家兔, 成功地制備了效價(jià)高、 特異性好的抗hCD1d?3多克隆抗體。 【關(guān)鍵詞】  C

3、D1d 3結(jié)構(gòu)域 表達(dá) 抗體 制備 Abstract  AIM: To prepare the rabbit antibody against the 3 domain of the human CD1d (hCD1d?3). METHODS: The gene fragment coding for hCD1d?3 was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET28, then expressed in E.coli BL21(DE3). The recombinant protein h

4、CD1d?3 was purified with Ni2+?NTA agarose column and used as immunogen to immunize the rabbit. The titer and specificity of the anti?hCD1d?3 antibody from the rabbit were analyzed by ELISA, Western blot and immunohistochemistry, respectively. RESULTS: The recombinant hCD1d?3 was successfully express

5、ed and purified, and the polyclonal anit?hCD1d?3 antibody was successfully prepared. The titer of the antiserum was 16400 by ELISA. Western blot analysis showed this antiboday reacted specifically with hCD1d. Immunohistochemistry analysis showed the antibody could recognize the native hCD1d in the h

6、uman intestinal tissue. CONCLUSION: The anti?CD1d?3 antibody from the rabbit with high titer and specificity has been prepared with purified recombinant hCD1d?3 as immunogen, which lays a foundation for further research into detection and functional study of CD1d.    KeywordsCD1d

7、; 3 domain; expression; antibody; preparation CD1分子獨(dú)立于MHC分子之外的一類特殊的抗原提呈分子。CD1d是其CD1家簇5個(gè)成員中的重要一員, 它提呈的抗原主要為脂質(zhì)分子, 供NKT細(xì)胞識別1, 在免疫調(diào)節(jié)、 NKT細(xì)胞的發(fā)育及與感染性疾病、 自身免疫性疾病、 腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程當(dāng)中起重要作用2-4。CD1d分子由胞外區(qū)、 跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)組成, 其胞外區(qū)含3個(gè)結(jié)構(gòu)域: 從氨基端開始依次為1、 2和3結(jié)構(gòu)域5。Kojo等6發(fā)現(xiàn)CD1d分子存在3結(jié)構(gòu)域缺失的變異體, 但尚未見進(jìn)一步的生物學(xué)功能研究報(bào)道。我們在研究中也發(fā)現(xiàn), 在一些腫瘤患者體內(nèi)存

8、在類似的CD1d變異體, 這些突變的CD1d分子存在的生物學(xué)意義尚不清楚, 有待研究。抗體是研究免疫分子的重要工具, 目前市場上尚未見有商品化的針對CD1d的3結(jié)構(gòu)域（CD1d?3）特異性抗體, 也未見有該抗體制備的研究報(bào)道。為此, 我們用通過PCR擴(kuò)增獲取了CD1d?3編碼區(qū)基因, 表達(dá)其重組蛋白, 制備其特異性抗體, 同時(shí)分析了其應(yīng)用的可能性。 1  材料和方法 1.1  材料  大腸桿菌DH5、 大腸桿菌BL21(DE3)為本室保存。雄性新西蘭大白兔由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供?？寺≥d體pGEM?T、 反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Promega公司產(chǎn)品。RNA 提取試劑、

9、 表達(dá)載體pET28和Ni2+?NTA 凝膠為Invitrogen公司產(chǎn)品。Taq酶和限制性內(nèi)切酶為大連寶生物工程公司產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物回收、 質(zhì)粒純化試劑盒為QiaGen公司產(chǎn)品。IPTG及DAB購自上海生物工程有限公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG為Dako公司產(chǎn)品。PVDF膜為美國PALL公司產(chǎn)品。常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純。PCR引物合成及DNA序列測定委托上海生物工程公司完成。 1.2  方法 1.2.1  CD1d?3編碼區(qū)基因的克隆  （1）人小腸組織總RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng): 取手術(shù)切除的新鮮小腸組織, 抽提RNA。經(jīng)電泳證實(shí)RNA無降解后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 操作

10、按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。（2）PCR 擴(kuò)增: 根據(jù)GenBank中人CD1d cDNA序列, 設(shè)計(jì)1對特異引物, 引物1: 5?CCATGGTGAAGCCCAAGGCCTGGCTG?3(劃線部分為Nco I酶切位點(diǎn)), 引物2: 5?CTCGAGCAGGACGCCCTGATAGGAAG?3(劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn)), 用以擴(kuò)增CD1d?3編碼區(qū)基因。PCR條件設(shè)定: 94變性30 s, 55退火30 s, 72延伸30  s, 32個(gè)循環(huán)后, 于72延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析并回收純化。（3）CD1d?3編碼區(qū)基因的鑒定: 將純化的PCR 產(chǎn)物

11、與pGEM?T載體連接后, 轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素、 X?gal和IPTG的LB平板上, 于37培養(yǎng)過夜, 挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng), 提取重組質(zhì)粒, 用EcoR I進(jìn)行酶切鑒定, 陽性克隆進(jìn)行DNA測序, 測序結(jié)果與GenBank中的DNA序列進(jìn)行同源性比較分析, 將質(zhì)粒命名為pGEM?T/hCD1d?3。    1.2.2  原核表達(dá)載體的構(gòu)建  用Nco I和Xho I分別對pGEM?T/hCD1d?3質(zhì)粒和原核表達(dá)載體pET28進(jìn)行雙酶切, 凝膠電泳后, 分別切取hCD1d?3基因片段和pET28片

12、段, 回收、 純化目的片段后, 用連接酶連接過夜, 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞, 然后將菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板, 篩選陽性表達(dá)克隆, 進(jìn)一步用PCR和測序進(jìn)行鑒定, 命名為pET28/hCD1d?3。 1.2.3  hCD1d?3在大腸桿菌中的表達(dá)  將pET28/hCD1d?3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 37培養(yǎng)過夜, 經(jīng)PCR篩選及測序鑒定, 陽性克隆于37振蕩培養(yǎng)過夜, 以150的比例接種到LB液體培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素）中, 培養(yǎng)至菌液的A600值到0.50.6時(shí)加入IPTG(終濃度為1mmol/L), 37誘導(dǎo)表

13、達(dá)6 h, 離心收集菌體, 超聲破碎后, 分別取細(xì)菌裂解上清、 沉淀部分及菌總蛋白進(jìn)行SDS?PAGE分析, 未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌為對照。 1.2.4  重組hCD1d?3的純化  將工程菌接種于500 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), 收獲細(xì)菌沉淀用50 mmol/L Tris?Cl(pH8.0)洗滌1次, 加入溶菌酶和DNaseI處理后, 置冰浴中超聲破菌, 15000 g離心收集沉淀, 洗滌后, 離心獲取沉淀, 溶于10 mL裂解緩沖液（8 mol/L尿素, 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液, pH7.8)中, 上樣至Ni2+?NTA凝膠柱, 在雜交條件（hybrid

14、condition）下進(jìn)行純化,  即在變性條件（denature condition）下上樣后, 分別用不同pH的變性洗滌液（denature wash buffer）和天然洗滌液（Native wash buffer）洗滌層析柱, 最后在天然條件（native condition）下洗脫目的蛋白。具體操作步驟按純化試劑盒說明書進(jìn)行。主要步驟如下: 上樣后, 分別用pH7.8、 pH6.0和pH5.3的變性洗滌液(8 mol/L尿素, 20 mmol/L磷酸鹽緩沖液)及天然洗滌液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液, pH8.0）充分洗滌, 最后用含200 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖

15、液洗脫回收。 1.2.5  抗體的制備及鑒定  將濃縮后的重組蛋白濃度調(diào)整為1 g/L, 與等量的佐劑研磨, 用于免疫家兔, 具體的制備方法參照文獻(xiàn)7進(jìn)行。免疫完畢, 經(jīng)頸總動(dòng)脈放血、 分離血清。用間接ELISA法檢測抗體效價(jià), 用Western blot對抗體特異性和活性進(jìn)行鑒定, 方法參照文獻(xiàn)7進(jìn)行。用人小腸組織作免疫組織化學(xué)檢測, 對抗體的活性和特異性作進(jìn)一步的分析, 多抗按1300稀釋, 采用DAB顯色。同時(shí)以正常家兔血清作對照。 2  結(jié)果 2.1  hCD1d?3編碼區(qū)基因的擴(kuò)增  1 g/L瓊脂糖凝膠電分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯示,&#

16、160; 在250 bp上邊附近有一條特異條帶(圖1), 與預(yù)期的目的片段大小相符, 經(jīng)測序鑒定, 得到hCD1d?3編碼區(qū)基因片段為279 bp, 堿基序無突變, 閱讀框正確, 陽性克隆命名為pGEM?T/hCD1d?3。    圖1  瓊脂糖凝膠電泳分析RT?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（略） Fig 1  Analysis of the PCR product of hCD1d?3 by agarose gel electrophoresis M: DNA marker; 1: PCR product of hCD1d?3.2.2 

17、 表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定  表達(dá)載體質(zhì)粒pET28和克隆質(zhì)粒pGEM?T/hCD1d?3經(jīng)Nco I和Xho I雙酶切后, 分別回收目的片段, 用連接酶連接后, 構(gòu)建表達(dá)載體pET28/hCD1d?3。經(jīng)PCR和DNA序列測定, 證實(shí)目的片段大小為279 bp的hCD1d?3編碼區(qū)基因片段正確插入pET28, 堿基序無突變, 3端含6×His序列, 閱讀框正確, 可用于下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。 2.3  重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、 純化與鑒定  將pET28/hCD1d?3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21?DE3,  得到含重組質(zhì)粒的基因工程菌。SDS?PAGE分析

18、表明, 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的該工程菌不表達(dá)外源蛋白, 而經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌在Mr約15000處有一條高表達(dá)的外源蛋白條帶, 與預(yù)測的目的蛋白的Mr相吻合, 重組蛋白的表達(dá)主要以包涵體的形式存在（圖2）。在雜交條件下純化重組蛋白, 從500 mL細(xì)菌培養(yǎng)液中純化得到約3 mg蛋白, 經(jīng)凝膠掃描分析顯示, 所得的蛋白純度為93%, 純度較高（圖2）。 2.4  抗血清的效價(jià)及特異性的鑒定  利用純化的重組hCD1d?3為抗原, 通過常規(guī)免疫家兔,    獲得兔抗hCD1d?3抗體, ELISA檢測效價(jià)其為16400, 可用于對抗原進(jìn)行檢測。以制備

19、的兔抗人CD1d?3血清作一抗,  進(jìn)行Western blot檢測, 結(jié)果顯示, 誘導(dǎo)表達(dá)菌蛋白及純化蛋白出現(xiàn)了特異反應(yīng)條帶, 而在未加誘導(dǎo)劑的菌體蛋白中未見有反應(yīng)條帶, 表明所制備的抗體與人CD1d特異結(jié)合。應(yīng)用所制備的抗體檢測人腸組織石蠟切片, 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, 制備的抗體作為一抗有明顯的陽性著色, 抗原分布主要呈胞膜型, 而應(yīng)用正常家兔血清為一抗則無陽性著色（圖3）, 說明所制備的兔抗hCD1d?3抗體可特異識別天然狀態(tài)下的CD1d分子, 抗體具有良好的活性和高特異性。 圖2  hCD1d?3重組蛋白的SDS?PAGE和抗體特異性的Western blot

20、鑒定分析（略） Fig 2  Aanalysis of the hCd1d?3 recombinant protein by SDS?PAGE and the the specificity of the  anti?hCD1d?3 by Western blot A: 1: Purified hCD1d?3 recombinant protein; 2: Supernatant of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1d?3 with IPTG induction; 3: Deposit of E.coli BL21(DE3) c

21、ontaining pET28/hCD1d?3 with IPTG induction; 4: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1d?3 with IPTG induction; 5: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1d?3 without induction; M: Protein marker. B: 1: Lysate of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1d?3 without induction; 2: Lysate

22、 of E.coli BL21(DE3) containing pET28/hCD1d?3 with IPTG induction; 3: Purified hCD1d?3 recombinant protein.    圖3  兔抗hCD1d抗血清特異性的免疫組織化學(xué)分析（略） Fig 3  Analysis of specificity of antiserum against hCD1d by Immunohistochemistry (×100) A: Rabbit antiserum against hCD1d?3

23、; B: Negative control(normal rabbit serum). 3  討論    CD1d主要表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞和小腸上皮細(xì)胞等細(xì)胞8, 9, 尤其是小腸上皮細(xì)胞基底膜側(cè)的細(xì)胞表面有大量的CD1d9。人CD1d分子胞外區(qū)含3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 即1、 2和3結(jié)構(gòu)域, 3結(jié)構(gòu)域含有93個(gè)氨基酸殘基。在實(shí)驗(yàn)中, 采用手術(shù)切除的小腸組織提取總RNA, 由于所用的組織選擇合理, 用RT?PCR技術(shù)成功地?cái)U(kuò)增出279 bp的CD1d?3編碼區(qū)基因片段, 序列與GenBank上登錄序列(登錄號: NM 001766)完全一致。為便于純化, 本實(shí)驗(yàn)選用

24、了含6×His的pET28載體。在重組蛋白的制備過程中, 發(fā)現(xiàn)重組CD1d?3蛋白主要以包涵體的形式存在, 通過Ni?NTA凝膠親和層析, 在雜交條件下純化目的蛋白, 即在變性條件下上樣, 經(jīng)過不同pH的變性緩沖液和天然緩沖液的洗滌后, 在天然條件下, 用咪唑進(jìn)行洗脫回收, 效果良好。由于洗脫回收產(chǎn)物不存在變性劑, 免去了樣品復(fù)性的麻煩。將純化的重組蛋白免疫家兔, 效價(jià)為16400, 免疫組化檢測顯示, 所制備的多克隆抗體能識別天然的CD1d分子, 表明其活性良好, 能用于下一步的相關(guān)研究工作。    CD1d分子是由有CD1d重鏈和2微球蛋白（2m）組

25、成的一個(gè)異二聚體分子,其結(jié)合部位是3結(jié)構(gòu)域5。正常情況下, 新生的CD1d在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與2m結(jié)合后, CD1d進(jìn)行折疊和二硫鍵的形成, 形成成熟的CD1d分子10。Kojo等報(bào)道了3結(jié)構(gòu)域缺失的CD1d分子變異體的存在5, 我們也在發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤患者體體內(nèi)存在類似的CD1d分子變異體。由于CD1d分子的抗原結(jié)合槽是由1和2結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的, 3結(jié)構(gòu)域缺失的CD1d分子變異體的抗原提結(jié)合位點(diǎn)依然完好, 其存在有何生物學(xué)意義？ 至今尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)針對CD1d的3結(jié)構(gòu)域, 成功制備其特異性抗體, 為進(jìn)一步開展CD1d及3結(jié)構(gòu)域缺失的CD1d分子變異體生物學(xué)功能研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 【參考文獻(xiàn)】 

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