抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗體的制備及其在牙胚細胞

1、抗P-21激活的磷酸化蛋白激酶5多克隆抗體的制備及其在牙胚細胞研究中的應用 作者：安政雯1,2；劉宏偉1,3；賈志敏4；李照峰1；Staffan Str觟mblad2；張宏權2(南方醫(yī)科大學1南方醫(yī)院口腔科，4藥學院，廣東 廣州510515；2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Sweden Huddinge SE-141 57；3同濟大學附屬口腔醫(yī)學院，上海  200072)摘要：目的  克隆PAK5-N 端基因并誘導其表達，進行多克隆抗體制備，為研究其在牙胚細胞中

2、的生物學功能奠定基礎。方法  根據(jù)人全長PAK5 cDNA序列，設計引物；利用PCR技術，以PAK5 全長cDNA為模板擴增PAK5-N端基因，將擴增產(chǎn)物克隆至pGEX-4T-1載體中，經(jīng)EcoRI /XhoI 雙酶切后進行重組質粒鑒定，DNA測序。以硫代半乳糖苷誘導其在大腸桿菌BL21中表達。利用GST融合蛋白純化系統(tǒng)進行蛋白純化，通過免疫家兔制備多克隆抗體，并在牙胚細胞中進行了初步研究。結果和結論  成功克隆了PAK5-N端基因，在E.coli中表達了PAK5-NT，并純化了GST融合蛋白，制備了PAK5特異性抗體。Western blotting

3、表明PAK5 在牙胚細胞中過度表達，為其在口腔細胞中的生物學功能研究提供了依據(jù)。關鍵詞：PAK5；基因克?。坏鞍妆磉_；多克隆抗體；牙胚細胞中圖分類號：R392.4  文獻標識碼：A  文章編號：1673-4254(2006)06-0730-04Preparation of anti-P21-activated kinase 5 polyclonal antibody and its application in dental germ cellsAN Zheng-wen1,2； LIU Hong-wei1,3； JIA Zhi-min4； LI Zhao

4、-feng1； Staffan Str觟mblad2； ZHANG Hong-quan2Department of Stomatology, Nanfang Hospital1, College of Pharmacy4, Southern Medical University, Guangzhou 510515，China; 2Karolinska Institute Department of Biosciences and Nutrition, Huddinge SE-141 57, Sweden; 3Affiliated Dental School of Tongji Universi

5、ty, Shanghai 200072, ChinaAbstract: Objective To clone PAK5-N terminal sequence for expression in E.coli to prepare its polyclonal antibody, and examine the role of PAK5 in dental germ cells. Methods  Based on human PAK5 cDNA sequence, PCR primers were designed to amplify PAK5-N terminal s

6、equence. The PCR product was cloned into the expression vector pGEX-4T-1 EcoRI/XhoI sites, and the recombinant plasmids were identified by agarose gel electrophoresis followed by DNA sequence analysis. The recombinant plasmids were transformed into E.coli BL21 and the expression of GST-fusion protei

7、n was induced by IPTG. Glutathione-Sepharose beads were used to purify GST-fusion PAK5-N-terminal fragment. Anti-PAK5 polyclonal antibody was obtained in immunizing rabbits with purified GST-PAK5 N-terminal fusion protein, and the antibodies were purified by protein A beads and used for detection of

8、 PAK5 expression in dental germ cells. Results and Conclusions We successfully cloned PAK5-N terminal gene fragment, and achieved protein expression, purification and production of PAK5-NT polyclonal antibody. The results of Western blotting indicated that PAK5 can be highly expressed in the dental

9、germ cells, suggesting that PAK5 may play an important role in biological function of dental germ cells.Key words: PAK5-N terminal; gene cloning; protein expression; polyclonal antibodies; dental germ cells收稿日期：2005-09-12基金項目：瑞典醫(yī)學會(17450)；瑞典癌癥基金會(050373)Supported by Swedish Medical Society(17450) an

10、d Swedish Cancer Foundation(050373)作者簡介：安政雯(1973-)，女，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師，E-mail: Zhengwen.Anbiosci.ki.se通訊作者：張宏權，電話：0046-8-6089267，傳真：0046-8-6081501，E-mail: Hongquan.Zhangbiosci.ki.se；劉宏偉，電話8121，傳真E-mail: hongwei_dds     P21 激活的磷酸化蛋白激酶 (PAKs) 作為Rho 家族中小GTP 酶，

11、Rac 和Cdc42 下游的效應因子以及MAPK信號通路上游的調控元件，包括2個亞家族(PAKI 和PAKII)，6個家族成員(PAK1-6)12。PAKs在調節(jié)細胞生長、增殖、分化、基因調節(jié)，細胞骨架重排以及細胞調亡等過程中起到重要作用3。PAK5 是一種最近被證實而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成員之一，屬于第二組PAK亞家族4。研究表明蛋白激酶在口腔細胞中參與重要的功能調節(jié)，如參與牙周膜細胞的成骨分化，牙槽骨代謝通路的調節(jié)以及在放線伴放線桿菌感染的牙周炎時參與口腔上皮細胞調亡的調控等567。本實驗構建了pGEX-4T-1-PAK5-NT表達載體，轉化E.coli BL21

12、受體菌，誘導其表達并制備多克隆抗體，初步鑒定了PAK5在牙胚細胞中高表達，為進一步研究PAK5在口腔細胞中的生物學作用提供了重要的研究基礎。    1  材料和方法    1.1  主要儀器    PCR儀(Santa Cruz Biotechnology)；凝膠圖像分析儀(Bio-RAD)；超聲裂解儀(Sonic & Materials INC. USA)；高速離心機(Kendro Laboratory Products. G

13、ermany)；超高速離心機(Beckman Coulter, Inc.)；搖床(K  hner Lab-Therm, Switzerland)；Western blotting 轉膜儀(Tamro med-lab, UK)。    1.2  主要試劑    DNA純化回收試劑盒和質粒DNA小量純化試劑盒(GENOMED GmbH, Germany)；質粒PCR-Blunt，載體質粒pGEX-4T-1，Glutathione Sepharose 4B和層析柱(Amersham

14、 Biosciences)；受體菌BL21 (Invitrogen)；DAN 電泳槽(Bio-RAD)；PVDF膜(Millipore Corporation, USA)。ECL(PerkinElmerTM)；-tublin 抗體(Lab Vision Corporation)；HRP-conj.goat anti-rabbit IgG抗體和HRP-conj.donkey anti-mouse IgG 抗體(Jakson)。    1.3  方法    1.3.1  引物&#

15、160; 根據(jù)人類cDNA文庫中PAK5全基因組序列，設計擴增N端基因的引物，引物由Invitrogen合成。5'端引物：5'-CCG AAT TCA TGT TTG GGA AGA AAA AGA A-3'加EcoRI酶切位點。3'端引物：5'-ATC TCG AGT CAC GAG GCT CTC TGA TAC TCC-3' 加Xho I酶切位點。    1.3.2  PCR擴增  反應物為：Primer1, Primer2, 10×PCR

16、buffer, 25 mol/L dNTP, template, Taq polymersase, dH2O，總反應體積100 l。PCR條件：94   1 min，55   1 min，72   1 min，35個循環(huán)；72   延伸7 min。擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收目的DNA片斷。    1.3.3  pGEX-4T-1-PAK5-NT重組質粒載體的構建   將目的片斷連接入pGEX-4T-1載體后轉化E.

17、coli BL21細菌、氨芐青霉素平板篩選、挑選陽性克隆、小量質粒制備及EcoR I/Xho I雙酶切獲得目的基因，進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。    1.3.4  序列分析   挑選上述陽性克隆，小量提取質粒酶切并測序。測序結果采用NCBI的BLAST 軟件與數(shù)據(jù)庫中已登陸的序列進行同源性分析，以驗證測序結果的正確性。    1.3.5  PAK5-NT蛋白的表達、純化及抗體制備   pGEX- 4T-1-PAK5-NT重組質粒轉

18、化E.coli BL21細菌、氨芐青霉素平板篩選、挑選4個陽性克隆分別置與氨芐青霉素終濃度為50 mg/ml的LB培養(yǎng)基中，在37 加入IPTG進行小量誘導。 取250 l誘導產(chǎn)物進行SDS-PAGE膠鑒定。然后挑選出表達GST-PAK5-NT的菌株再進行大量誘導。誘導產(chǎn)物分別置與高速離心管中，6500 r/min離心20 min，收集離心沉淀物經(jīng)液氮反復凍融，超聲裂解及1%Triton X-100處理獲取細胞中的蛋白，按GST融合蛋白純化系統(tǒng)的方案進行蛋白純化，SDS-PAGE膠進行產(chǎn)物鑒定。將純化分離出來細胞上清全部在SDS-PAGE膠中進行蛋白分離，切膠回收GST-PAK5-NT特異性的

19、蛋白條帶。再將回收膠置于透析袋，加入TAE液，4 透析過夜后，在DAN電泳槽中50 V，電泳6 h使蛋白從膠中游離出來進入透析袋的TAE中，收集濃縮含GST- PAK5-NT的TAE液至2 ml。分別取濃縮液1 l，2 l與GST標準蛋白在SDS-PAGE膠中進行蛋白定量。當?shù)鞍缀看笥? mg/ml時，即可用于抗體制備。本實驗抗體由BioGenes GmbH，Germany制備。經(jīng)免疫2只家兔，20 d后第1次放血，2月后二次放血而制備出多克隆抗體。Western blotting進行抗體鑒定。    1.3.6  牙胚細胞中PAK

20、5 蛋白表達水平的鑒定   牙胚細胞裂解液由本室保存，為第3代大鼠牙胚細胞。原代細胞取自出生4 d后大鼠的下頜骨第1，2磨牙牙胚。一般認為PAK5在神經(jīng)細胞中表達高，而在其他組織中表達低。本實驗共取4種細胞裂解液蛋白10 g與牙胚細胞裂解液一起，利用Western bloting鑒定，抗體稀釋度為11000。    2  結果    2.1 PAK5 NT基因片斷的擴增    PAK5 NT基因編碼序列672 bp；PCR產(chǎn)物用1.5%

21、瓊脂糖凝膠電泳，可見在700 bp附近有一條特異性條帶(圖1)，與目的基因片斷大小相近。     圖1  PCR擴增基因片斷鑒定電泳圖    Fig.1 PCR amplification of the target gene fragment    M: DNA marker; Lanes 1-4: Amplified PAK5-NT    2.2  重組質粒的鑒定  

22、60; pGEX-4T-1-PAK5-NT重組質粒經(jīng)EcoRI/XhoI雙酶切后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，可見兩條特異性條帶，大小分別約為4900和672 bp(圖2)，與預期大小相符。    2.3  DNA序列分析    將上述鑒定的陽性克隆擴大培養(yǎng)后，提取質粒進行DNA序列分析。圖3示部分N端基因片斷的測序結果。經(jīng)BLAST分析，與已知的PAK5-N端蛋白基因序列一致。     圖2  pGEX-4T-1-PAK5-NT

23、重組質粒的構建與鑒定    Fig.2  Construction and identification of the pGEX-4T-1-PAK5-NT recombinant plasmids    M: DNA marker; Lanes 1-6: The upper bands are the expression vector pGEX-4T-1 after EcoRI/XhoI cleavage and the lower bands are the target gene frag

24、ment PAK5-NT    2.4  蛋白表達、純化及定量    pGEX-4T-1-PAK5-NT重組質粒轉化E.coli BL21細菌，經(jīng)IPTG小量誘導后，產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳鑒定(圖4)，可見第3，5，7行出現(xiàn)特異性條帶，表明2，3，4株克隆誘導成功。    對成功誘導的3株克隆進行大量培養(yǎng)后，獲得PAK5-NT的蛋白表達，經(jīng)GST蛋白純化系統(tǒng)純化后，產(chǎn)物SDS-PAGE電泳鑒定(圖5)，結果顯示目的蛋白在洗脫液2和3管中含量最高(第4，

25、5行)，在細胞沉淀中含量最少(第2行)。表明我們可以在細胞上清中得到可溶性的目的蛋白。    用標準GST蛋白對目的蛋白進行粗略的蛋白定量，結果表明目的蛋白含量大于1 mg/ml(圖6)，因此可以用于抗體制備。     圖3  PAK5-NT基因的序列分析    Fig.3 DNA sequence analysis of the PAK5-NT gene fragment    圖4經(jīng)IPTG小量誘導后的蛋白表達產(chǎn)

26、物SDS-PAGE電泳鑒定    Fig.4 Identification of protein expression by SDS-PAGE after IPTG induction    M: Protein marker; Lanes 1,3,5,7: Clones 1-4 induced by IPTG; Lanes 2,4,6,8: Clones 1-4 without IPTG induction    圖5  GST-PAK5蛋白純化產(chǎn)物SD

27、S-PAGE電泳鑒定    Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified GST-PAK5-NT fusion protein    M: Protein marker; Lane 1: Flowthrough; Lane 2: Pellet; Lanes 3-6: Elutes of 1-4 EP tubes    圖6  蛋白定量的SDS-PAGE電泳分析    Fig.6 SDS-PA

28、GE analysis of purified PAK5-NT protein quantified by GST standard protein    Lanes 1-4: Different amount of GST standard protein as controls; Lanes 5-6: 1 and 2 l of the target protein for quantification compared with GST standard protein    2.5  PA

29、K5 在牙胚細胞中的高表達    比較PAK5在牙胚細胞與人類成纖維細胞及其他3種神經(jīng)纖維瘤細胞中的表達(蛋白上樣量為10 g)，Western blotting 證實PAK5在牙胚細胞中表達最高(圖7)。     圖7  PAK5抗體鑒定及在不同細胞系中的表達    Fig.7  Identification of PAK5 polyclone antibody and expression of PAK5 in different

30、cell lines    DGC: Dental germ cells; BJA: Human fibroblast; CRL2149,CRL2271, HTB11: Human neuroblastoma    3  討論    P21激活的PAKs是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶，可以和Rho家族中的小GTP酶，Cdc42和Rac結合，并在某些情況下被激活，調節(jié)細胞加工，例如基因轉錄，細胞形態(tài)、動力和調亡8。1994年第一個P21激活的磷酸化蛋白激酶，PA

31、K1，作為Rac相互作用的蛋白被證實8。隨后，其他PAK家族成員相繼被證實，包括兩個亞家族的6個成員。這些蛋白激酶結構保守又非常相似，都含有N端的p21蛋白結合域(PBD)和C端的激酶域(KD)，只是組織分布不同。根據(jù)其保守的結構，PAK1-3組成PAK I亞家族，而PAK4-6構成了PAK II亞家族。由于PAK I亞家族還含有N端的自體抑制域(AID)，使之區(qū)別于PAK II亞家族。    由Dan等人首次提出在人類基因組中存在PAK5基因。PAK5基因全長編碼序列為2160 bp，編碼719個氨基酸。 隨后PAK5被證實為一種新的功能性的蛋白激酶，

32、不同與PAK1-3，在結構上與PAK4類似10，屬于PAKII亞家族。最近研究顯示，PAK5可增加細胞粘附3，并在一些信號轉導通路中發(fā)揮作用1112。PAK5在口腔細胞中的研究尚無報道。    我們期望獲得PAK5的多克隆抗體，為下一步深入研究提供實驗材料，所以本實驗利用基因重組技術成功克隆了PAK5 N端基因。 PAK5 N端基因序列為672 bp，編碼224個氨基酸。為了提高酶切效率，首先將PCR擴增產(chǎn)物與PCR-Blunt載體連連，然后再用EcoR I/Xho I雙酶切下目的基因，從而獲得有兩個粘端，可以高效連接的基因片斷，再將此基因片斷與具有相同

33、酶切位點的表達載體pGEX-4T-1連接，瓊脂糖凝膠電泳及DAN測序表明所克隆的基因正確。曾選用多種E.coli 菌株誘導蛋白表達，實驗證明在BL21中表達最好，而在TB菌株中卻表達很弱。在蛋白表達過程中， IPTG誘導劑加入之前，應監(jiān)測細菌的D()值。當D()值在0.51之間時，細菌生長呈對數(shù)增長，此時加入IPTG，在37 誘導3 h，可以獲得高表達的可溶性目的蛋白。在IPTG誘導表達時，適宜的溫度很重要，低溫時易得到可溶性的蛋白，但表達量可能會降低。當溫度升高時，可能會增加表達量，同時也易形成不溶性的包涵體，則很難進行蛋白的純化。本實驗曾試圖在室溫下進行誘導，但未能成功，而在37 ，短時間

34、誘導，得到了高表達的可溶性蛋白，說明此實驗條件為適宜條件。我們選用GST-融合蛋白純化系統(tǒng)進行蛋白純化，可以得到高產(chǎn)量的GST-PAK5融合蛋白，最后通過免疫家兔獲得了多克隆抗體，并初步證實PAK5在牙胚細胞中高表達，使進一步認識和研究PAK5在口腔細胞中的生物學功能成為可能。盡管目前有一種編號為#B50226的抗PAK5多克隆抗體出現(xiàn)，用于Western blot檢測時，該抗體的使用濃度為1500倍稀釋，但本實驗制備的抗體，在同樣條件下，使用濃度可以達到11000倍稀釋，效價更高，特異性更強，而且本抗體還可以用于免疫熒光和免疫組織化學研究(結果未示)。故該抗體不僅可以用于口腔細胞的生物學研究

35、，為其他學科相關細胞的研究也提供了寶貴的實驗材料。    (責任編輯：陳望忠)    參考文獻：    1Hofmann C, Shepelev M, Chernoff J. The genetics of PakJ. J Cell Sci, 2004, 117(Pt 19): 4343-54.    2Pandey A, Dan I, Kristiansen TZ, et al.  Cloning and char

36、acterization of PAK5, a novel member of mammalian p21-activated kinase-II subfamily that is predominantly expressed in brainJ. Oncogene, 2002, 21(24): 3939-48.    3Faure S, Cau J, de Santa Barbara P, et al. Xenopus p21-activated kinase 5 regulates blastomeres' adhesive proper

37、ties during convergent extension movementsJ. Dev Biol, 2005, 277(2): 472-92.    4Ching YP, Leong VY, Wong CM, et al. Identification of an autoinhibitory domain of p21-activated protein kinase 5J. J Biol Chem, 2003, 278(36): 33621-4.    5Kawarizadeh A, Bourauel C, Gotz W, et al. Early responses of periodontal ligament cells to mechanical stimulus in vivoJ. J Dent Res, 2005, 84(10): 902-6.    6Hagel-Brad