質(zhì)粒提取總結(jié)(原理、小提、中提、濃度測定)

1、堿裂解法抽提質(zhì)粒原理 溶液I，50 mM葡萄糖 /25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；（溶菌酶：使細(xì)胞壁裂解；RNase：將裂解完的RNA去除，防止RNA污染） 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3M醋酸鉀 / 2 M醋酸。溶液I的作用：任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液。50mM葡萄糖：加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA：EDTA是C

2、a2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá)10 mM的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。溶液II：這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備

3、0.4N的NaOH，是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。其實破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)D

4、NA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA也會斷裂?；蚪MDNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細(xì)說明。溶液III溶液III加入后就會有大量的沉淀，最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性

5、沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。SDS專門喜歡和蛋白

6、質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。 那么2M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多

7、人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。溶III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。 酚對蛋白質(zhì)的

8、變性作用遠(yuǎn)大于氯仿，按道理應(yīng)該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應(yīng)（比如限制性酶切反應(yīng)），應(yīng)此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進(jìn)行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必?fù)?dān)心酶切等反應(yīng)不能正常進(jìn)行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面

9、更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。這時候如果放到-20，時間一長反而會導(dǎo)致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50ug/ml）的TE緩沖液進(jìn)行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結(jié)果的。瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不

10、要認(rèn)為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質(zhì)粒后再進(jìn)行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復(fù)制中間體（即沒有復(fù)制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠(yuǎn)離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。質(zhì)粒小提質(zhì)粒小提（這里試劑盒沒有柱平衡步驟）：1、大離心管4000rpm離心5min，吸除上清；2、每5ml菌液加入250l P1（4），徹底懸浮，移到1.5ml EP離心管

11、中；3、加入250l P2，上下顛倒6-8次，溫和，5min；4、加入350l P3，上下顛倒6-8次，溫和；12000rpm離心10min；5、取上清，加到柱子里，12000rpm離心2min，棄廢液；6、加入去蛋白液HB 500l，12000rpm離心1min，棄廢液；7、加入75%乙醇700l，12000rpm離心1min，棄廢液；8、重復(fù)上一步；9、空離一次，12000rpm離心2min，棄收集管；10、晾干；11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm離心2min。12、測濃度質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型）：天跟 本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，再通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地

12、結(jié)合溶液中的DNA。1、柱平衡：向吸附柱CP3（吸附柱放入收集管中）加入500l的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；2、取1-5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機，12000rpm離心1min，盡量吸除上清；注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。3、向離心管中加入250l溶液P1（先檢查是否加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；4、向離心管中加入250l溶液P2（使用后立即蓋上瓶蓋，以免空氣中的CO2中和P2中的NaOH反應(yīng)，降低溶菌效率），溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，使菌液充

13、分裂解；注意：溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。此時菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時間不應(yīng)超過5min，以免質(zhì)粒收到破壞，如果未變得清亮，可能由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。5、加入350l溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)68次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000rpm離心10min；注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。6、吸取上一步上清液轉(zhuǎn)移至吸附柱CP3中（吸附柱放入離心管中），盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中；7、可選

14、步驟：向吸附柱CP3中加入500l去蛋白液PD，12000rpm離心30-60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。如果宿主菌是end A+宿主菌（TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等），這些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解質(zhì)粒DNA，推薦采用此步。如果宿主菌是end A-宿主菌（DH5，TOP10等），此步可省略。8、向吸附柱CP3中加入600l漂洗液PW（先檢查是否已加入無水乙醇），12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中；9、重復(fù)操作步驟8；10、將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心兩分鐘，目的是將吸

15、附柱中殘余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。11、將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100l洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50l，體積過小影響回收效率。洗脫液的PH值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其PH在7.0-8.5范圍內(nèi)，PH低于7.0會降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，

16、以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。質(zhì)粒中提實驗步驟(E.Z.N.A. TM EndoFree Plasmid Midi Kit)實驗前準(zhǔn)備1. 使用前,將RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。2. 按下表用無水乙醇稀釋DNA Wash Buffer，并于室溫保存。D6915-01: 加入80ml無水乙醇D6915-03: 每瓶加入200ml無水乙醇D6915-04: 每瓶中加入200ml無水乙醇操作方案1. 將帶有質(zhì)粒的E.coli 接種于30-50ml LB/抗生

17、素培養(yǎng)液中，37C搖床培養(yǎng)1216 h； 2. 取30-50ml的菌液，室溫下3500-5000xg（4000）離心10min收集細(xì)菌。3. 倒棄培養(yǎng)基。加入2.5ml Solution I/RNaseA混和液，漩渦振蕩使細(xì)胞完全懸浮。4. 往重懸混和液中加入2.5ml Solution II，輕輕顛倒混勻7-10 次后可將混合液室溫放置2min以提高產(chǎn)量。避免劇烈混和裂解液且裂解反應(yīng)不要超過5 min。5. 加入1.25ml 冰浴Buffer N3，并溫和顛倒離心管數(shù)次至形成白色絮狀沉淀。準(zhǔn)備好過濾器。6. 把HiBind中量柱套在收集管中，加入2ml Buffer GPS至柱子中，靜置3-

18、10min。室溫3000- 5000xg離心5分鐘。去濾液，把柱子重新放回收集管中。7. 將裂解液倒進(jìn)預(yù)先準(zhǔn)備好的針筒過濾器中(針筒開口朝上，下面出口處接收集管)，靜置2min。8. 插入并輕推活塞使裂解液流進(jìn)下面的收集管中。9. 在過濾澄清的裂解液中加入1/10體積的ETR，顛倒7-10次后溶液變得渾濁，冰浴10-20min。10. 42C水浴5min后，25 ，3000-5000xg離心5min， ETR溶液將在管底形成藍(lán)色分層。離心后，如果溶液中有大量的液滴懸浮，靜置10分鐘讓液滴自然沉降。11. 轉(zhuǎn)移上清液移至離心管中，加入0.5倍體積無水乙醇(室溫)，混勻后室溫靜置1-2min。12

19、. 將HiBind 中量柱裝在15ml收集管中。轉(zhuǎn)移20ml（分兩次轉(zhuǎn)，具體看實際）混合液至柱子內(nèi)，室溫下3000-5000xg離心3-5 min，倒去濾液。13. 重復(fù)該第12步驟，把剩余的過濾液轉(zhuǎn)移至柱子，直至所有的溶液都從柱子濾出。14. 把柱子重新裝回收集管，加入3ml HB Buffer，按上述條件離心，棄濾液。15. 把柱子重新裝回收集管，加入3.5ml DNA Wash Buffer，按上述條件離心，棄濾液。16. 重復(fù)步驟15一次。17. 棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，最大速度（6000xg，4000）離心10-15min以甩干柱子基質(zhì)。18.放十分鐘左右曬干，然后將柱子放在新離心管中，向柱子中心加0.5-1ml ddH2O，4000xg離心5min測濃度?！?8.（可選）進(jìn)一步干燥柱子,將柱子從收集管中取出，用真空抽濾裝置抽干柱子10min后，也可在真空烘箱或65C 干燥10min后重復(fù)步