消敏顆粒對Ⅰ型超敏反應(yīng)模型大鼠血清IgE含量及脾細胞IFN-γ mRNAIL-4 mRNA表達的影……

1、消敏顆粒對型超敏反應(yīng)模型大鼠血清IgE含量及脾細胞IFN- mRNA，IL-4 mRNA表達的影響                              作者：李忻紅，王惠國，關(guān)洪全【摘要】  目的研究消敏顆粒抗大鼠型超敏反應(yīng)的免疫學(xué)機制。方法用卵白蛋白與AI(OH)懸液的混合液致敏和誘發(fā)，制成型超敏反應(yīng)

2、動物模型。將實驗動物隨機分組，即正常組、模型組、消敏顆粒低、高劑量組、撲爾敏組，分別給予相應(yīng)的藥物進行動物實驗。采用ELISA法測定致敏大鼠血清IgE含量。采用RT-PCR 方法，檢測致敏大鼠脾淋巴細胞分泌IFN- mRNA、IL-4 mRNA的表達水平。結(jié)果消敏顆?？山档脱蹇侷gE含量，可促進IFN-及mRNA表達，抑制IL-4 mRNA表達（P<0.01或P<0.05），均有顯著性差異。結(jié)論消敏顆粒具有抗型超敏反應(yīng)的作用。 【關(guān)鍵詞】  消敏顆粒 型超敏反應(yīng) 免疫球蛋白E 干擾素 白介素-4 Abstract：ObjectiveTo investigate

3、 the immunological  mechanism of Xiaomin granules on type hypersensitivity.MethodsTo sensitize and lead rat with the mixture of (OVA)and AI(OH).To make the experimental animal  model  for type hypersensitivity. Divide the animals for experiment into groups randomly, named normal group

4、，model group，vacant control group, Xiaomin granule (low-and high-dose)groups, chlorpheniramine group, and  experimentize the anminals with homologous  medication  respectively. The IgE content in serum of sensitized rats was measured with ELISA. T Lymphocytes in Sensitized rats measur

5、ed with RT-PCR.ResultsXiaomin granules could decrease the content of IgE in serum，increase the expression of IFN- mRNA，inhibit the expression of IL-4 mRNA（P<0.01 or P<0.05）.They all had remarkable differences.ConclusionXiaomin granules has the effect on the Type hypersensitivity.Key words：Xiao

6、min granules；  Type hypersensitivity；  IgE；  IFN-;  IL-4型超敏反應(yīng)是主要由IgE介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，消敏顆粒在臨床治療慢性蕁麻疹等型超敏反應(yīng)性疾病取得良好的療效，為了進一步研究其治療機制，本文通過大鼠型超敏反應(yīng)動物模型，觀察抑制IgE產(chǎn)生的作用，探討消敏顆?？剐统舴磻?yīng)的免疫調(diào)節(jié)機制。1  器材1.1  動物Wistar大鼠50只,體重200220 g，雄雌各半，購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心實驗室。隨機分5組，即正常組、模型組、消敏顆粒低

7、、高劑量組、撲爾敏組。1.2  藥物消敏顆粒（由消敏飲制備），組方為黃芪20 g，防風(fēng)15 g，當(dāng)歸15 g，金銀花15 g，芥穗15 g，蒺藜15 g，甘草15 g，購自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。生理鹽水注射液，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；撲爾敏，北京太平洋藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。1.3  試劑卵白蛋白，AI(OH)國藥集團化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；1gE ELISA試劑盒，上海森雄公司分裝；Trizol，invitrogen公司；DEPC，DNA-marker DL2000，Rt-pcr試劑盒，寶生物工程有限公司（TaKaLa）產(chǎn)品。1.4  引物序列設(shè)計本實驗選用GAPDH

8、（三磷酸甘油醛脫氫酶）為內(nèi)參照，根據(jù)文獻報道在IFN-，IL-41，GAPDH序列5', 3'分別設(shè)計上下游引物，并在美國國立生物信息中心基因庫進一步核準(zhǔn)大鼠基因全序列。目的基因及內(nèi)參照GAPDH引物由北京華大基因中心合成，基因序列見表1。表1  PCR引物（略）1.5  儀器550號微孔板酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司生產(chǎn)）；酶標(biāo)儀洗板機（美國BIO-RAD公司生產(chǎn)）；DY89-電動玻璃勻漿機（寧波新芝科器研究所生產(chǎn)）；BIOFUGE28RS低溫高速離心機（德國HERAEUS生產(chǎn)）；PE9600 PCR儀（美國PERKIN ELMER生產(chǎn)）；EPS-300

9、電泳儀（上海天能生產(chǎn)）；DYCP-33A電泳槽（北京六一儀器廠生產(chǎn)）。2  方法2.1  消敏顆粒制備消敏飲取14劑，分別將藥物混合后浸泡30 min，煮沸后繼續(xù)煎30 min，共煎2次，合并2次煎液，并分別濃縮至糖漿狀，再與糊精混合均勻，粉碎干燥，在陰涼干燥處保存，使消敏顆粒每克含生藥1 g。實驗時將消敏顆粒濃度調(diào)配成為每毫升含生藥1，3 g。2.2  給藥方法灌胃量4 ml/只，正常組和模型組每天灌服生理鹽水4 ml/只；低劑量組、高劑量組分別灌服消敏顆粒20，60 g/kg；撲爾敏組4 mg/kg。2.3  I型超敏反應(yīng)動物模型的制備以生理鹽水配制

10、AI(OH)懸液(10 g/L)，除正常組各組大鼠均腹腔注射卵白蛋白(OVA 1 mg)與AI(OH)懸液(1 ml)的混合液進行初次免疫，第10天重復(fù)1次。從初次免疫后第6天開始給藥，共14 d。2.4  實驗方法和觀察指標(biāo)2.4.1  消敏顆粒對大鼠血清IgE生成的影響第14天，型超敏反應(yīng)大鼠模型未處死前取血，離心后取血清。采用ELISA法測定致敏大鼠血清IgE含量，按ELISA試劑盒說明書操作，顯色終止后酶標(biāo)儀測定450 nm處光吸收值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待測樣品中IgE的濃度。百事通2.4.2  消敏顆粒對IFN- mRNA、IL-4 mRNA表達的影響采用R

11、T-PCR (逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法，檢測對致敏大鼠脾淋巴細胞分泌的IFN-mRNA、IL-4 mRNA表達的情況。大鼠處死后取脾組織，進行總RNA提取，然后將動物細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測cDNA中Bcl-2 mRNA序列，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，置于紫外線檢測儀上觀察結(jié)果，并拍照留做記錄，電泳結(jié)果采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，分析特異性擴增條帶的各強度值。IFN- mRNA及IL-4 mRNA的表達用Bcl-2 mRNA相對表達量表示（Bcl-2 mRNA相對表達量=Bcl-2帶強度值/內(nèi)參條帶強度值）。2.5  統(tǒng)計學(xué)方法計量資料實驗數(shù)據(jù)以±s

12、表示。所獲數(shù)據(jù)采用 SPSS10.0版本軟件進行單因素方差分析，方差齊性檢驗用Homagenelty of variance test；組間比較，方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhanes T法。3  結(jié)果3.1  消敏顆粒對大鼠血清IgE生成的影響見表2。模型組血清IgE含量明顯高于正常組，說明造模成功。消敏顆粒低、高劑量組及撲爾敏組均低于模型組，其中高劑量組及撲爾敏組降低更明顯，與模型組比較有顯著性差異（P<0.01），但兩者間無顯著性差異（P>0.05），且高劑量組與正常組亦無顯著性差異（P>0.05）。表2  消敏顆粒對大鼠血清

13、IgE生成的影響(略)3.2  消敏顆粒對IFN- mRNA、IL-4 mRNA表達的影響見圖1，脾組織中IFN-、IL-4和內(nèi)參照擴增后電泳結(jié)果，消敏顆粒組和撲爾敏組IFN- cDNA經(jīng)擴增后可見光亮的條帶，消敏顆粒高劑量組和撲爾敏組強于其它組。模型組IL-4 cDNA擴增后其亮度增強于正常組和各用藥組，正常組條帶最暗。見表3，大鼠脾組織IFN- mRNA的表達模型組顯著低于正常組(P<0.01)；治療后各組表達增強，消敏顆粒高劑量組和撲爾敏組增加更明顯，與模型組比較差異有顯著意義(P<0.01)。大鼠脾組織IL-4 mRNA的表達模型組顯著升高，與正常組比較差異具有顯

14、著性意義(P<0.01)，模型組與治療各組比較差異具有顯著性意義，其中與消敏顆粒高劑量組和撲爾敏組差異更顯著(P<0.01)，且消敏顆粒高劑量組與撲爾敏組比較差異無顯著性（P>0.05）。4  討論以慢性蕁麻疹為代表的皮膚型超敏反應(yīng)的發(fā)生，主要是以IgE介導(dǎo)，導(dǎo)致肥大細胞、嗜堿性粒細胞等釋放一系列生物活性介質(zhì)， 從而引起機體生理功能發(fā)生紊亂。針對某種變應(yīng)原的特異性IgE 型抗體是引起I 型超敏反應(yīng)的主要因素。正常情況血清中總IgE 抗體含量很低，而發(fā)生型超敏反應(yīng)時，IgE 抗體含量則顯著增高。所以，在該類疾病治療中，主要以抑制IgE產(chǎn)生為目的。另外，Th1/Th2亞

15、群及其相互之間的平衡在免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵的作用。Th2促進B細胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE在與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的高親和力IgE受體FcR I結(jié)合而使機體處于致敏狀態(tài)，當(dāng)變應(yīng)原再次進入機體結(jié)合IgE后，誘發(fā)速發(fā)型超敏反應(yīng)2。Romagnani報告，Th2細胞在變態(tài)反應(yīng)性疾病中的作用并非僅僅局限于促進B細胞產(chǎn)生IgE，也可以通過產(chǎn)生1L-4，5，13等Th2型細胞因子直接或間接地引起超敏反應(yīng)的病理生理改變和臨床表現(xiàn)3。IL-4可誘導(dǎo)B淋巴細胞的IgE 合成和分泌，也可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞低親和力IgE受體的表達和細胞因子的合成和分泌4。Th2 細胞的活化可被Th1 細胞分泌的細胞因子IFN-

16、 和DC、巨噬細胞分泌的IL-12 抑制。因此，提高Th1 細胞活性，減少IL-4 及IL-13 的產(chǎn)生，進而增加IgG（如IgG4）抗體產(chǎn)生，可降低IgE 抗體的產(chǎn)生。Th1和Th2之間通過細胞因子而互相調(diào)節(jié)。目前研究已經(jīng)表明，IL-4可以促進IgE合成，而IFN-能抑制IL-4所誘導(dǎo)的IgE合成，說明Th1和Th2細胞均調(diào)控IgE的合成。 因此，IL-4和IFN-的相互制約的平衡調(diào)節(jié)可能是IgE合成的重要因素。表3  消敏顆粒對IFN-mRNA，IL-4mRNA表達的影響(略)本實驗結(jié)果表明型超敏反應(yīng)模型大鼠血清IgE含量明顯升高，治療各組均能降低IgE水平，消敏顆粒高劑量組降低更明顯，基本恢復(fù)正常，療效與撲爾敏組相當(dāng)。模型組脾組織IFN- mRNA的表達顯著降低，用藥后治療各組明顯恢復(fù)，消敏顆粒高劑量組恢復(fù)較明顯。模型組脾組織IL-4 mRNA的表達顯著升高，治療各組表達水平均下降，其中消敏顆粒高劑量組和撲爾敏組下降更顯著，且二者療效相當(dāng)。提示消敏顆?？梢砸种蒲蹇侷gE產(chǎn)生，還提示消敏顆粒也可通過提高IFN-，降低IL-4，抑制IgE的產(chǎn)生，說明消敏顆粒治療慢性蕁麻疹等皮膚型超敏反應(yīng)性疾病可通過抑制IgE的產(chǎn)生這一免疫學(xué)機制完成?！緟⒖嘉墨I】  1付文祥，謝 慧，熊大經(jīng)五龍顆粒對實驗