DNA分子熒光探針

1、DNA 分子熒光探針陳秀英 彭孝軍 *(大連理工大學(xué)精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 大連 116012摘 要 介紹了各種 DNA 熒光探針的結(jié)構(gòu)特征、熒光性質(zhì)和與 DNA 的作用方 式,概述了 DNA 探針在生物分子分析方面的應(yīng)用,并展望了 DNA 熒光探針的發(fā)展 趨勢(shì)和應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞 熒光探針 DNA 花菁染料 光穩(wěn)定性 量子點(diǎn)DNA Fluorescence ProbesChen Xiuying, Peng Xiaojun*(State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian 116012

2、Abstract The structure characters, fluorescence properties and the functional ways of the various kinds of probes for DNA, including some applications on the detection of biomolecules, were reviewed, and the trends and prospect on the progress of DNA fluorescence probes were discussed too.Key words

3、Fluorescence probe, DNA, Cyanine, Photostability, Quantum dotDNA 是生命遺傳的重要物質(zhì), DNA 分子的定量分析和特異識(shí)別對(duì)基因組學(xué)、病毒學(xué)、分 子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展具有十分重要的意義。由于生物分子自身的熒光較弱,目前多采用 熒光探針?lè)z測(cè)。熒光探針?lè)ㄝ^傳統(tǒng)的同位素檢測(cè)速度快,重復(fù)性好,用樣量少,無(wú)輻射,在 DNA 自動(dòng)測(cè)序、抗體免疫分析、疾病診斷、抗癌藥物分析等方面已得到廣泛應(yīng)用 1,2。 DNA 熒 光探針的靈敏度是影響檢測(cè)結(jié)果的重要因素,因而開(kāi)發(fā)更靈敏的熒光探針,同時(shí)避免生物熒光 背景的干擾已成為目前研究的熱點(diǎn)。下面對(duì)

4、DNA 分子熒光探針的結(jié)構(gòu)、功能及對(duì) DNA 的分析 應(yīng)用技術(shù)方面作一介紹。1 吖啶、菲啶類吖啶、菲啶類染料是應(yīng)用最早的核酸熒光探針,它們通過(guò)嵌入或靜電吸引與 DNA 分子結(jié) 合,使 DNA 的熒光大大增強(qiáng),是序列非特異的小分子探針。N(H3C 2N N(CH3 2HCl吖啶橙陳秀英 女, 28歲,博士生,現(xiàn)從事生物探針?lè)矫娴难芯俊?*聯(lián)系人 E-mail: pengxj教育部重大項(xiàng)目和國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (20128005, 20376010吖啶的基本結(jié)構(gòu)為二苯并吡啶,在水溶液中呈弱堿性。 1940年,發(fā)現(xiàn)當(dāng)吖啶橙與酸性物質(zhì) 連接或存在于酸性物質(zhì)中時(shí),其特征光譜會(huì)發(fā)生一定的變化,至此一直被

5、用于生物體的染色。 吖啶橙可與 DNA 或 RNA 作用,與雙鏈 DNA(dsDNA結(jié)合后的熒光激發(fā) /發(fā)射波長(zhǎng)分別為 502/538nm(水 3。為提高染料穩(wěn)定性及熒光強(qiáng)度,大量的吖啶衍生物被合成。 Pavel 等 4合成了 系列硫代吖啶,并用毛細(xì)管液相色譜對(duì)其定量純化分析。 Naofumi 5合成了 10-羧甲基吖啶酯, 其熒光及穩(wěn)定性都有很大提高,同時(shí)含有的羧基活性基可與生物分子共價(jià)結(jié)合。 Cao 等 6在吖 啶橙給體與番紅 T 受體之間建立了熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET定量測(cè)定 DNA 的方法,其中給體 的最大發(fā)射波長(zhǎng)要與受體的吸收波長(zhǎng)重疊,對(duì)小牛胸腺 DNA 的檢測(cè)限為 2.6

6、15;10-7mol ·L -1。該 法雖然靈敏度較高,但易受到牛血清白蛋白和人血清白蛋白的干擾。一些吖啶的絡(luò)合物,會(huì)對(duì) 小溝及 DNA 序列特異識(shí)別,有望成為 DNA 的轉(zhuǎn)錄抑制劑,控制核酸的表達(dá) 7,8。對(duì)位氨基取代 的喹吖啶化合物對(duì)三鏈 DNA 有高度的穩(wěn)定作用及選擇性,而且該類化合物表現(xiàn)出光活性,成 為 DNA 的光切斷劑 9。溴乙錠是應(yīng)用較廣的菲啶類探針,溴乙錠可結(jié)合單鏈 (ssDNA、雙鏈及多鏈 DNA ,與核酸 結(jié)合后,熒光增強(qiáng) 2030倍,激發(fā)波長(zhǎng)紅移 3040nm ,發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移, Stokes 位移較大。 雙嵌入劑乙錠均二聚物 (Ethidium homodi

7、mer, EthD 的嵌入部分使染料分子與 DNA 之間形成十H 2NNH 22CH 3BrH 2N22 32 22 32H 2N4Cl 溴乙錠乙錠均二聚物分牢固的親和力,連接常數(shù)約 1011(溴乙錠僅為 105 ,同時(shí)對(duì)三鏈 DNA 有高親和作用,因而更 利于應(yīng)用到抗體、抗癌藥物的基因水平的研究。 Gherghi 等 10用汞滴電極研究了溴乙錠、吖啶橙 與 dsDNA 的作用,結(jié)果顯示它們的作用方式完全不同。利用 488nm 氬離子激光激發(fā)和共聚焦 熒光成像掃描系統(tǒng)對(duì) EthD 與 DNA 的復(fù)合物檢測(cè), 瓊脂糖凝膠電泳后, 檢測(cè)靈敏度可達(dá) pg(10-12g 級(jí) 11。溴乙錠探針研究 ds

8、DNA 與樹(shù)枝狀大分子 (Dendrimer的相互作用 12,對(duì)于細(xì)胞修復(fù)、分 子識(shí)別等基因生命學(xué)有深遠(yuǎn)意義。富含堿基 G 的 ssDNA 可以形成分子內(nèi)四鏈結(jié)構(gòu),溴乙錠的 一些衍生物可以增加 DNA 四鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并作為研究四鏈結(jié)構(gòu)的熒光探針 13。它們的一些 光譜性質(zhì)見(jiàn)表 13,14,15。2 菁類染料2.1 TOTO 類吖啶橙、溴乙錠類染料雖然與核酸結(jié)合穩(wěn)定,但未結(jié)合的染料自身的熒光會(huì)造成高的熒光 背景, 干擾檢測(cè), 同時(shí)溴乙錠具有很大毒性。 TOTO 和 YOYO 是由 Glazer 等開(kāi)發(fā)的一類對(duì) dsDNA 具有高度親和力的不對(duì)稱菁染料 16,17。染料在溶液中無(wú)熒光,降低了檢測(cè)

9、過(guò)程中的熒光背景干 擾。與 dsDNA 結(jié)合后發(fā)生強(qiáng)烈的熒光,熒光增強(qiáng)約 1000倍,染料分子與 DNA 的堿基對(duì)最大 比例可達(dá) 1/4,在瓊脂糖凝膠和丙烯酰胺凝膠電泳中穩(wěn)定。它們分別由單體噻唑橙 TO 和噁唑黃 YO 通過(guò)一個(gè)多亞甲基胺柔性鏈連接成二聚體。 YOYO 是 TOTO 的類似物,只是其中用苯并噁唑替換了苯并噻唑。 改變多亞甲基鏈兩端的染料分子, 可以得到不同的異二聚體 TOTAB 、 TOTIN 等。該類染料還有 POPO 、 BOBO 以及不對(duì)稱單亞甲基菁染料 PO-PRO 、 BO-PRO 、 TO-PRO 、 YO-PRO 等,共軛鏈碳數(shù)增加,吸收及發(fā)射波長(zhǎng)產(chǎn)生紅移。 Ry

10、e 等認(rèn)為 ssDNA-TOTO 復(fù)合物穩(wěn) 定性及光譜性質(zhì)的變化在于 TOTO 頭部基團(tuán)與單鏈堿基之間的堆積作用和鏈上兩個(gè)陽(yáng)離子正電 荷與 DNA 骨架上的負(fù)電荷之間的庫(kù)侖力共同作用的結(jié)果 18。 TOTO 可高選擇性地用于 dsDNA 的非序列特異性的檢測(cè),它對(duì)所有的 dsDNA 表現(xiàn)出極高的親和作用,但更易嵌入 dsDNA 的 (5'-CTAG-3' 2位,大約是 100倍的選擇性,其次是 (5'-CTGA-3'2位,大約 50倍的選擇性 19。 Jason 等 20用溶液粘度測(cè)定法和原子力顯微鏡解釋了 TOTO 與 DNA 的雙嵌入作用。MeSO 4n4I

11、 4IY=O, YO n =0,Y=S, TOTO; n =0,Y=O, YOYO TOTIN Y=S, TO n =1,Y=S, TOTABMeSO 4 4I 3 3 nY=O, PO Y=S, BOBO n =0, Y=O, PO-PRO-1; n =0, Y=S, BO-PRO-1Y=S, BO Y=O, POPO n =1, Y=O, PO-PRO-2; n =1, Y=S, BO-PRO-2與 DNA 的高度嵌合使這類染料熒光極大增強(qiáng),廣泛用于 DNA 的染色。利用激光激發(fā)共聚 焦熒光凝膠掃描檢測(cè)系統(tǒng), 瓊脂糖凝膠電泳, TOTO 及 YOYO 與 dsDNA 復(fù)合物的檢測(cè)限是 4p

12、g , 較傳統(tǒng)的溴乙錠染色用量低 500倍 21。 Zhu 等 22利用毛細(xì)管電泳分離 DNA 碎片, TOTO 染色后 靈敏度可達(dá)到每區(qū)帶 24amol(10-18mol 堿基對(duì)。 Stephan 等以共聚焦掃描熒光檢測(cè)的方法,對(duì) TOTO 染色過(guò)的微量 DNA 碎片尺寸定量分析,不同長(zhǎng)度的 DNA 碎片熒光強(qiáng)度不同,可檢測(cè)到 長(zhǎng)度為 214kbp(bp,指堿基對(duì) 的碎片,不確定度為 7%14%。該法采用玻璃覆蓋的載片,表面涂有廉價(jià)的聚賴氨酸等涂層,具有很好的應(yīng)用前景 23。 YOYO-1可以作為新的 DNA 縮合作 用探針,弱酸性 (pH5.7條件下, YOYO 嵌入的單個(gè) DNA 分子

13、(48.5kbp 被破壞成直徑為 100 150nm 的環(huán)狀結(jié)構(gòu),用光捕捉可觀測(cè)到單個(gè)與縮合的 DNA 分子之間的構(gòu)象轉(zhuǎn)化,達(dá)到 150ms 的時(shí)間分辨 24。 Claire 等 25發(fā)現(xiàn),在 DNA 存在時(shí) YO 和 YOYO 會(huì)產(chǎn)生光漂白,其原因主要在 于氧化的堿基 8-氧代 -7,8-二羥基脫氧鳥嘌呤能使嵌入的 YOYO 熒光猝滅。TOTAB 、 TOTIN 、噻唑橙和溴乙錠異二聚物 TOED1、 TOED2、熒光素和溴乙錠異二聚物 FED 等可用于研究在給體與受體之間的能量轉(zhuǎn)移。與 dsDNA 結(jié)合后,給體熒光團(tuán)發(fā)射的熒光 約 90%被猝滅,而受體熒光團(tuán)的熒光較同樣條件下的單體熒光增強(qiáng)

14、 100倍以上,提高了分析靈 敏度。用于 DNA 自動(dòng)序列分析中,單一波長(zhǎng)的光源激發(fā)染料對(duì),經(jīng)過(guò) FRET 過(guò)程后,在不同 波長(zhǎng)下發(fā)射,因而實(shí)現(xiàn)了單一光源激發(fā)多色檢測(cè)。 TOTO 類染料雖然價(jià)格貴,但標(biāo)記快速,接 近生理 pH 條件,對(duì)生物分子的功能活性影響小。染料與 dsDNA 結(jié)合后的性質(zhì)見(jiàn)表 1。表 1染料與 dsDNA 結(jié)合后的熒光性質(zhì)Tab.1 Fluorescence properties of dyes coupled with dsDNA染料 量子產(chǎn)率 最大激發(fā) /發(fā)射波長(zhǎng) /nm熒光增強(qiáng)倍數(shù) 連接常數(shù) ×10-4/(L·mol -1·cm -1

15、信噪比 參考文獻(xiàn) 吖啶橙 0.43502/5381.53.1×1045.3(DMSO或 DMF 1.23溴乙錠 0.15526/604211.5×1050.32(DMSO或 DMF 1.33 YOYO-10.52491/5094606×1089.9(DMSO或 DMF 3.93 TOTO-10.34514/53314001.1×10911.7(DMSO或 DMF _3TOTIN 吸收波長(zhǎng) 506;547發(fā)射波長(zhǎng) 531;673367.9;14.64(甲醇 14TOTAB 吸收波長(zhǎng) 507;636發(fā)射波長(zhǎng) 532;6581267.76;10.1(甲醇 14

16、POPO-1434/4569.2(水或甲醇 15BOBO-1462/48111.4(水或甲醇 15PO-PRO-1435/4555.0(水或甲醇 15BO-PRO-1462/4815.8(水或甲醇 15值由 DNA-染料復(fù)合物在水或甲醇中與單體染料對(duì)照的結(jié)果2.2 花菁染料2.2.1花菁染料的特點(diǎn) 嵌入式熒光染料對(duì) DNA 序列不能特異識(shí)別,且其最大發(fā)射波長(zhǎng)一般小 于 600nm ,然而生物分子在紫外區(qū)有弱熒光,為避免生物分子的自熒光,開(kāi)發(fā)近紅外熒光染料已 成為研究的熱點(diǎn)?；ㄝ既玖系哪栁障禂?shù)大,熒光發(fā)射波長(zhǎng)范圍寬,一般在 6001000nm 的 近紅外區(qū),可大大避免生物自身的熒光背景干擾,

17、與成本較低的激發(fā)光源如半導(dǎo)體激光器匹配, 用于 DNA 自動(dòng)測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng) (PCR檢測(cè)及抗體免疫分析等。由 Waggoner 等 26開(kāi)發(fā)的一 類多甲川類花菁染料,當(dāng)中間的共軛雙鍵數(shù) n 是 1、 2、 3時(shí),分別為 CY3、 CY5、 CY7系列菁12 R 4R 312R 3R 4染料。每增加一個(gè)共軛雙鍵,最大吸收波長(zhǎng)紅移 100nm ,共軛雙鍵數(shù)越多,染料越不穩(wěn)定。苯 并噻唑或苯并吲哚取代吲哚環(huán)后,最大吸收發(fā)生紅移。近紅外菁染料共價(jià)標(biāo)記具有特異性,標(biāo)記更穩(wěn)定,貯存期長(zhǎng)。2.2.2光穩(wěn)定性 活性氧如單線態(tài)氧、超氧化物、過(guò)氧化物等氧化還原活性物質(zhì)被認(rèn)為是熒光團(tuán) 產(chǎn)生光降解而褪色的主要原因

18、?；ㄝ既玖系墓馄资怯捎趩尉€態(tài)氧對(duì)多亞甲基鏈的攻擊。為了 提高染料的光穩(wěn)定性,常將母體中的多亞甲基鏈改變?yōu)榉剿岘h(huán)、環(huán)戊烯、環(huán)己烯等剛性環(huán)結(jié)構(gòu), 或在分子外部共價(jià)引入或摻雜環(huán)糊精等 27,28。姚祖光等發(fā)現(xiàn)染料用含氯環(huán)己烯取代亞甲基鏈結(jié) 構(gòu)并將吲哚的 1位用大體積的芳環(huán)取代后,染料的光穩(wěn)定性會(huì)顯著增強(qiáng) 29。2.2.3染料的標(biāo)記 (標(biāo)記試劑的生成 將染料標(biāo)記在一定序列的寡核苷酸上可獲得具有特異性的 寡核苷酸探針,同時(shí)運(yùn)用熒光 PCR 擴(kuò)增技術(shù),可得到高靈敏度的探針?；ㄝ既玖吓c寡核苷酸的共價(jià)標(biāo)記位一般在吲哚環(huán)的 R 1 位上, R1位的活性基團(tuán)通過(guò)琥珀酰亞胺酯活化后,與連接臂的一端結(jié)合,連接臂的另

19、一端與寡核苷酸的核糖或堿基共價(jià)連接?；钚曰鶊F(tuán)一般為含羧基的取代基,為提高染料的水溶性及穩(wěn)定性,常在吲哚環(huán)的 R 3 、 R4位引入水溶性基團(tuán),如磺酸基等。有的在 R 3 、 R4位引入活性基,而在 R1、 R2位引入磺酸基。也可采用鄰苯二甲酰亞胺酯或異硫氰酸酯。一般寡核苷酸的多處標(biāo)記會(huì)使熒光信號(hào)增強(qiáng) 30,但由于染料之 間及染料與核酸間的聚集 (Aggregation,多處標(biāo)記后的寡核苷酸會(huì)發(fā)生一些性質(zhì)的變化,如降 低了探針的穩(wěn)定性和熒光亮度。同時(shí),寡核苷酸的尺寸很小,因此要想增強(qiáng)探針的靈敏度,必 須考慮改變熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)以抑制染料的聚集。連接臂的長(zhǎng)度也會(huì)影響探針的靈敏性,連接臂過(guò) 短,會(huì)影響探

20、針的穩(wěn)定性及后面的雜交檢測(cè)。 Waggoner 等 31經(jīng)過(guò)體外實(shí)驗(yàn),獲得了優(yōu)化探針, 即每隔 6個(gè)堿基通過(guò)連接臂標(biāo)記一個(gè) CY3染料。2.2.4應(yīng)用 花菁染料廣泛用于 DNA 自動(dòng)測(cè)序和核酸、蛋白質(zhì)及抗體的標(biāo)記等。 Duthie 等 32合 成了菁染料 CY5、 CY5.5標(biāo)記的二脫氧核糖三磷酸酯結(jié)構(gòu)用于單色 DNA 測(cè)序。 James 等 33合成 了近紅外花菁染料異氰酸酯和琥珀酰亞胺酯作為生物探針標(biāo)記試劑,但酯化反應(yīng)收率及純度都 很低。 鄭洪等 34以近紅外花菁染料的熒光猝滅測(cè)定核酸, 測(cè)定范圍是 0.081.2µg/mL。 Yang 等 35將羧基引入近紅外花菁染料,毛細(xì)管電

21、泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè),可以處理并檢測(cè) 0.8amol 的染料。 由于染料水溶性好,需高效液相色譜 (HPLC分離,因而限制了其應(yīng)用。 Wellington 等 36用三步 合成了穩(wěn)定性較好的近紅外菁染料 NIR820(激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為 790和 820nm ,并避免了 HPLC 分離 , 使產(chǎn)品分離能力達(dá)到克量級(jí),解決了標(biāo)記用染料的合成及純化問(wèn)題 , 促進(jìn)了生物標(biāo)記 試劑的發(fā)展。HOOC3-HO 3SNIR8203 熒光素和羅丹明類熒光素 1是 1871年由 V on Bayer合成的,最大吸收 /發(fā) s 射在 492/571nm(水中 ,量子產(chǎn)率 為 0.92(pH>837。由于熒光

22、強(qiáng)度大,大量的熒光素衍生物被合成并用作熒光檢測(cè)試劑。如 5(6- 化學(xué)通報(bào) 2004 年 第 67 卷 w68 羧基熒光素 2、5(6-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯 3、5-碘乙酰胺熒光素 4、熒光素異硫氰酸酯 5 等 是應(yīng)用最廣泛的熒光衍生試劑，用于病毒學(xué)、細(xì)胞學(xué)及免疫組織化學(xué)。將熒光素共價(jià)連接到核 酸、寡核苷酸、藥物、蛋白質(zhì)及其它分子來(lái)合成探針，用于基因病毒的檢測(cè)及表達(dá)38。熒光素 也存在一些缺點(diǎn)：如熒光素共軛體不穩(wěn)定，熒光測(cè)試儀的強(qiáng)激光，使之發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的光漂白， X HO Y O X O Y COOH X=H, Y=H, R=H 1 R=COOH 2 O

23、R=CO2N O 3 R=NHCOCH2I 4 R=NCS 5 X=H, Y=F, R=COOH 6 X=Y=F, R=COOH 7 R O O N O OCH3 O O O O OH O N OH O 8 9 導(dǎo)致熒光信號(hào)的迅速下降；熒光素在水溶液中以離子形式存在，吸收及熒光性質(zhì)易受 pH 影響； 與標(biāo)記物共軛連接后，易發(fā)生猝滅。Sun 等38在熒光素分子中引入氟使其光穩(wěn)定性有很大提高并 降低了離子化的 pH。Gao 等39合成了光穩(wěn)定性好的含單羧基的熒光素衍生物，其中 8 的穩(wěn)定性 是 1 和 BODIPY 熒光染料的 10 倍， 但是熒光強(qiáng)度卻較 1 下降了 4 倍。 它們的光譜性質(zhì)見(jiàn)表

24、 238。 表2 熒光素衍生物 1 2 6 7 pH 9.0 磷酸緩沖溶液 吸收/發(fā)射波長(zhǎng)/nm 492/517(水 492/516 492/517 510/534 熒光素的光譜性質(zhì) 量子產(chǎn)率 0.92 0.92 0.92 0.59 /(L·mol-1·cm-1 90000 84700 78100 Tab.2 Spectral properties of fluoresceins 羅丹明染料由于分子呈剛性平面，有較高的熒光量子產(chǎn)率，故熒光較強(qiáng)，已成為商品化染 料；但 Stokes 位移較小，吸收區(qū)域的低能量部分與發(fā)射區(qū)的高能量部分重疊，導(dǎo)致染料的激發(fā) 輻射損失。 常見(jiàn)的有羅

25、丹明 B、 羅丹明 6G、 羅丹明 101、 德克薩斯紅等。 等40合成了 Phosphin3R Zhu H N NH2 COOH COOH NO3 N O ClO4 羅丹明 101 N (C2H52N O ClO4 羅丹明 B N(C2H52 NH2 Phosphin3R 探針，該探針成本較低，是一種基于熒光猝滅來(lái)快速檢測(cè)核酸的熒光染料，最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng) 6 化學(xué)通報(bào) 2004 年 第 67 卷 w68 為 468/505nm。核酸存在時(shí)，熒光會(huì)顯著猝滅，對(duì)小牛胸腺 DNA 的檢測(cè)限為 5.0ng/mL，沙門 桿菌的檢測(cè)限是 6.0ng/mL。 4 噻

26、嗪和噁嗪類染料 這類染料分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，合成方便，但熒光量子產(chǎn)率較低，限制了其應(yīng)用。主要有耐爾藍(lán)、 耐爾紅和噁嗪 750 等。耐爾藍(lán)通過(guò)與 DNA 作用，染料的熒光被猝滅，通過(guò)熒光強(qiáng)度的減弱來(lái) 檢測(cè) DNA 的含量。JA242 噁嗪染料與發(fā)夾結(jié)構(gòu)寡核苷酸端基連接形成智能探針(Smart probe， 雜交前被莖桿結(jié)構(gòu)處互補(bǔ)的鳥嘌呤殘基所高度猝滅。當(dāng)與特異的靶序列結(jié)合時(shí)，發(fā)夾打開(kāi)，染 料與鳥嘌呤分離，熒光增強(qiáng)約 6 倍，可以檢測(cè) pmol (10-12mol級(jí)的核酸濃度41。 CH3 N N C2H5 N C2H5 耐爾藍(lán) N NH2 C2H5 N C2H5 噁嗪 720 H 3C H3 C N

27、C2 H5 O N (CH23 COOH O O NH2 JA242 5 BODIPY(Boron dipyrromethene difluoride染料 BODIPY 染料熒光量子產(chǎn)率高，熒光波長(zhǎng)范圍寬，可以通過(guò)調(diào)節(jié) R1、R2 取代基，獲得不同 的熒光發(fā)射波長(zhǎng)，一般用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針。BODIPY 熒光標(biāo)記的 G 三磷酸酯核苷類似 物作為 G 蛋白親和探針(Affinity probe，毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)，檢測(cè)限為 2nmol42。 N R1 B N R2 F F BODIPY 6 其它類別探針 6.1 稀土元素探針 稀土離子也是一類核酸探針的檢測(cè)試劑。 在水溶液中僅有 Tb

28、(和 Eu(發(fā)出熒光， DNA 與 配合后仍保留熒光性能，可特異識(shí)別核苷酸。Tb(和 Eu(與一些小分子配體配合，由于配 體本身性質(zhì)、中心離子-配體成鍵及溶劑等因素影響，使配合物的激發(fā)態(tài)壽命達(dá)到 ms 級(jí)，并發(fā) 出窄而強(qiáng)的熒光。Tb(和 Eu(與小分子的配合物探針通過(guò)共價(jià)鍵與靶 DNA 共價(jià)結(jié)合后多用 于實(shí)時(shí)定量熒光 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的分析及雜交測(cè)試。該類探針要求稀土配合物易于合成并且足夠 穩(wěn)定，同時(shí)熒光發(fā)射強(qiáng)度大。Nurmi 等43用 Tb(和 Eu(標(biāo)記的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)同步擴(kuò)增及前 列腺特異抗原的測(cè)定，信噪比要高于傳統(tǒng)的 TaqMan 探針，而循環(huán)閾值則降低。 6.2 量子點(diǎn)熒光探針 量子點(diǎn)

29、熒光探針是由-族和-族元素組成的半導(dǎo)體納米顆粒，將核酸連接到量子點(diǎn) 的表面，做成探針，通過(guò)體外雜交常規(guī)熒光(FISH分析，發(fā)現(xiàn)染色體的異常及變異，可取代一 些有機(jī)熒光染料進(jìn)行生物分子檢測(cè)。研究較多的有 CdSe、CdTe、ZnS 等。量子點(diǎn)探針可以在有 機(jī)溶劑中制備，但須經(jīng)過(guò)一定的化學(xué)修飾，使其表面具有一定的水溶性基團(tuán)，同時(shí)又具備一些 7 化學(xué)通報(bào) 2004 年 第 67 卷 w68 與生物分子偶連的活性基團(tuán)，因而反應(yīng)條件苛刻，步驟復(fù)雜，成本較高。盡管在水溶液中制備 的成本低，但量子點(diǎn)的熒光產(chǎn)率低，尺寸分布較大。目前較多采用在有機(jī)溶劑中合成。在強(qiáng)激 光下易

30、發(fā)生光漂白，是有機(jī)類熒光染料最普遍的缺陷。量子點(diǎn)探針較傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料具有 一定的優(yōu)越性。首先，熒光光譜范圍寬，通過(guò)改變納米晶體材料和尺寸，獲得的激光誘導(dǎo)熒光 光譜范圍在 400nm2µm；其次，熒光光譜范圍可調(diào)，穩(wěn)定性好，熒光壽命長(zhǎng)，且可用單一波 長(zhǎng)的激發(fā)光源同時(shí)激發(fā)不同大小尺寸的量子點(diǎn)，得到不同熒光發(fā)射波長(zhǎng)的檢測(cè)信號(hào)，相對(duì)于有 機(jī)熒光染料的單一光源激發(fā)得到單一熒光發(fā)射信號(hào)，降低了實(shí)驗(yàn)成本并簡(jiǎn)化了分析步驟。1998 年，Bruchez 等44制備了 CdSe-ZnS 核-殼結(jié)構(gòu)的納米晶體，之后又增加了 SiO2 層，使其具有水 溶性，同時(shí) SiO2 經(jīng)過(guò)修飾后可以與生物分子結(jié)合，

31、量子產(chǎn)率高且穩(wěn)定。Nie 等45將量子點(diǎn)的表 面連接上巰基乙酸，使量子點(diǎn)不僅具有水溶性，同時(shí)可與生物分子連接。Pathak 等46將量子點(diǎn) 表面用眾多的羥基修飾，解決了量子點(diǎn)探針雜交過(guò)程中的水溶性問(wèn)題，同時(shí)降低了量子點(diǎn)表面 大分子的非特異連接，穩(wěn)定性也大大增加。以上量子點(diǎn)都是在有機(jī)溶劑中合成的，林章碧等47 以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，在水溶液中，合成了尺寸為 3nm 的 CdTe 半導(dǎo)體納米粒子?？傊?，量子 點(diǎn)熒光探針用于生物熒光標(biāo)記，是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的領(lǐng)域。 7 結(jié)語(yǔ) 目前，DNA 熒光探針要解決的問(wèn)題是提高靈敏度，增強(qiáng)光穩(wěn)定性，降低合成成本。不同的 DNA 熒光探針各有優(yōu)缺點(diǎn)，有機(jī)類染料中

32、近紅外染料具有一定的優(yōu)勢(shì)，尤其是近紅外菁染料將 會(huì)更多的被合成并應(yīng)用于生物分子的檢測(cè)，其光穩(wěn)定性有待提高。量子點(diǎn)探針作為一個(gè)新興的 領(lǐng)域，必將受到越來(lái)越多的重視。相信不久的將來(lái)，隨著新型、性能優(yōu)異的熒光探針的開(kāi)發(fā)， 人類將能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)一些生物過(guò)程運(yùn)用多種方法、多種參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)、動(dòng)態(tài)研究，這將極大 地推動(dòng)基因組學(xué)及相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。 參考文獻(xiàn) 1 J W Richard, M P Jose, T Victor et al. Applied Spectroscopy, 1997, 51:836843. 2 K Licha, C Hessenius, A Becke et al. Bioconjug

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