阿司匹林對胃癌細胞株SGC7901增殖及核因子κB表達的影響

1、阿司匹林對胃癌細胞株SGC7901增殖及核因子B表達的影響         11-03-24 13:07:00     編輯：studa20                      作者：姚紅波 李永金 陶燕 黃曉佳 陳永昌【摘要】  目的： 探討阿司匹林對胃癌細胞S

2、GC7901增殖及核因子B p65（NFB p65）表達的影響。方法： 培養(yǎng)胃癌細胞株SGC7901，采用MTT法檢測阿司匹林在不同濃度和不同作用時間下對胃癌細胞增殖的影響；DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡；蛋白質(zhì)印跡法和免疫熒光法檢測阿司匹林對胃癌細胞 NFB p65表達的影響。結(jié)果： MTT結(jié)果顯示，在0.110 mmol/L濃度區(qū)間內(nèi)，隨濃度增加和時間的延長，阿司匹林對SGC7901細胞的抑制率逐漸增加。SGC7901細胞經(jīng)10 mmol/L阿司匹林作用6 h和12 h后，細胞發(fā)生凋亡。隨著阿司匹林作用濃度增加和作用時間延長，胃癌細胞 NFB p65的表達逐漸降低。結(jié)論： 阿司匹林對胃癌

3、細胞SGC7901的增殖具有抑制作用，且與阿司匹林的濃度和作用時間呈正相關(guān)，其作用機制可能與通過抑制胃癌細胞NFB p65的表達而使細胞發(fā)生凋亡有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  胃癌細胞； 阿司匹林； 核因子B； 細胞凋亡    Abstract  Objective: To investigate the effect of aspirin on proliferation and nuclear factor kappa B expression in gastric cancer cell line SGC7901. Methods： Gastric

4、 cancer cell line SGC7901 was treated with aspirin of different concentrations or different time, effect of aspirin on proliferation and apoptosis in SGC7901 was evaluated by MTT assay and DNA agarose gel electrophoresis; expression of nuclear factor kappa B p65 was determined by Western blotting an

5、d immumofluorescence method. Results： Aspirin can inhibit the proliferation of SGC7901 among concentrations of 0.110 mmol/L. As the dose and time increased, the inhibitory of aspirin on proliferation of SGC7901 was significantly increased. Apoptosis was detected by DNA agarose gel electrophoresis af

6、ter treating with aspirin of 10 mmol/L for 6 or 12 hours. Aspirin reduced expression of NFB p65 in a concentration and time dependent pattern.  Conclusion： Aspirin inhibited proliferation of gastric cancer cell line SGC7901; the  inhibition of NFB p65 expression inducing cellular apoptosis

7、 may ascribed to mechanism of antiproliferation activity of aspirin.    Key words  gastric cancer cell;  aspirin;  NFB p65;  apoptosis    近年來研究表明，阿司匹林對胃腸道腫瘤具有預(yù)防作用1，能抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，其作用機制包括多個方面但并不很明確。過去大量研究顯示，阿司匹林通過抑制環(huán)加氧酶2（COX2）活性，下調(diào)COX2的表達而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)2

8、。但目前很多研究提示，阿司匹林能通過非COX2依賴性途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。核因子B（NFB）信號通路便是其中之一。NFB是細胞中的重要轉(zhuǎn)錄因子，在受到各種激活因子如腫瘤壞死因子（TNF）刺激時，NFB與抑制分子IB解離而被活化，p50p65二聚體進入細胞核發(fā)揮基因調(diào)控作用3,4。本實驗通過MTT法, DNA的瓊脂糖凝膠電泳以及蛋白質(zhì)印跡法，研究阿司匹林對胃癌細胞SGC7901增殖的抑制作用和對NFB p65表達的影響，初步探討其抑瘤機制。    1  材料和方法    1.1  材  料 

9、0;  人胃癌細胞株SGC7901由中科院上海細胞生物研究所提供。小牛血清（蘭州民海生物），DMEM（Gibco公司）。NFB p65抗體（碧云天生物技術(shù)研究所），羊抗兔IgG（中杉公司），F(xiàn)ITC antirabbit IgG（Santa Cruze公司）。阿司匹林（Sigma公司）。酶標(biāo)儀為BioRad 公司產(chǎn)品。    1.2  細胞培養(yǎng)     人胃癌細胞株SGC7901用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)，置于37，5% CO2的孵育箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底后，用0.25%胰蛋白酶和0.02% ED

10、TA的混合消化液消化成單細胞，傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。    1.3  MTT實驗     取對數(shù)生長期的SGC7901細胞，用上述消化液消化后制成單細胞懸液，記數(shù)，調(diào)整細胞密度為4×104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔200 l（每孔8 000個），取不含細胞的培養(yǎng)液作空白調(diào)零。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各孔分別加入終濃度為0.1，1，5，10 mmol/L的阿司匹林，以不含阿司匹林的培養(yǎng)液作為陰性對照，各組設(shè)3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24，48，72 h后，各孔加入0.5%的MTT 20 l，

11、繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸除孔內(nèi)液體，各孔加入150 l DMSO，震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測光密度（D）值，并計算阿司匹林對SGC7901細胞的抑制率，抑制率=（1-實驗組D均值/對照組D均值）×100%。該實驗重復(fù)3次。    1.4  DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡    1.4.1  DNA提取  取對數(shù)生長期的SGC7901細胞接種于6孔板內(nèi)，以終濃度為10 mmol/L的阿司匹林分別作用6，12，24 h；收集細胞至EP管中，加入DNA提取緩沖液進行提取，將最終收集

12、的DNA沉淀溶于適量滅菌水中。    1.4.2  電泳  取5 l DNA樣品，加入0.5 l上樣緩沖液，混勻后用1%的瓊脂糖凝膠在100 V，10 mA條件下電泳1 h。在紫外燈下進行觀察。    1.5  蛋白質(zhì)印跡法檢測NFB p65的表達    1.5.1  核蛋白的提取  細胞接種和處理同“1.4”。用預(yù)冷的PBS洗2次，將細胞刮下移至EP管中，4離心5 min收集細胞。各EP管中細胞經(jīng)緩沖液A，PMSF，緩沖液B作用后提取到核蛋白。將蛋白樣品

13、與2×上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，-20保存?zhèn)溆谩?#160;   1.5.2  蛋白質(zhì)印跡  10%的SDSPAGE，各泳道上樣量為8 l，先80 V電泳20 min，然后以100 V電泳1.5 h分離蛋白樣品。    1.5.3  電轉(zhuǎn)膜  4，90 mA恒流轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)好后取出PVDF膜，在5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。    1.5.4  與抗體反應(yīng)  將膜與1500稀釋的NFB p65抗體4孵育過夜，用TBST漂洗3次，每次5 mi

14、n。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（15 000稀釋），室溫下孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min。用ECL發(fā)光劑顯示陽性條帶，在Typhoon分子成像系統(tǒng)上掃描結(jié)果，用軟件測得NFB p65和GAPDH條帶的灰度值，將兩者的比值作為半定量結(jié)果（相對值），作出直方圖。并進行統(tǒng)計學(xué)分析。    1.6  免疫熒光法檢測NFB p65的表達     將SGC7901細胞接種在置于24孔細胞培養(yǎng)板中的蓋玻片上，密度為30左右，培養(yǎng)24 h后加入不同終濃度的阿司匹林，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞用新配的4%低聚甲醛固定4過夜，PBS洗3遍；用0.3%的TritonX100作用8 min以使細胞膜通透性增加；加3%BS