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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：劉**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：天津 上傳時(shí)間：2022-01-30 格式：DOC 頁數(shù)：11 大小：162KB 積分：20 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、基因定點(diǎn)突變?nèi)ヂ?、定點(diǎn)突變得目得把目得基因上面得一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基 .二、定點(diǎn)突變得原理定點(diǎn)突變就是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （PCR） 等方法向目得 DNA片段（可以就是基因組， 也可以就是質(zhì)粒 ）中引入所需變化 （通常就是表征有利方向得變化） , 包括堿基得添加、 刪除、 點(diǎn)突變等。 定點(diǎn)突變能迅速、 高效得提高 DNA所表達(dá)得目得蛋白得性狀及表征， 就是基因研 究工作中一種非常有用得手段。體外定點(diǎn)突變技術(shù)就是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間得復(fù)雜關(guān)系得有力工具， 也就是實(shí)驗(yàn) 室中改造 /優(yōu)化基因常用得手段。 蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu)決定其功能 , 二者之間得關(guān)系就是蛋白質(zhì)組研 究得重點(diǎn)之一。對某個(gè)已知基

2、因得特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入 , 可以改變對應(yīng)得 氨基酸序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)， 對突變基因得表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功 能得關(guān)系 ,探討蛋白質(zhì)得結(jié)構(gòu) /結(jié)構(gòu)域。 而利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因： 比如野生型得綠色熒 光蛋白（ wtGFP）就是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱得綠色熒光, 經(jīng)過對其發(fā)光結(jié)構(gòu)域得特定氨基酸定點(diǎn)改造 , 現(xiàn)在得 GF能在可見光得波長范圍被激發(fā) （吸收區(qū)紅移 ）, 而且發(fā)光強(qiáng)度比 原來強(qiáng)上百倍 , 甚至還出現(xiàn)了黃色熒光蛋白 ,藍(lán)色熒光蛋白等等。 定點(diǎn)突變技術(shù)得潛在應(yīng)用領(lǐng) 域很廣 , 比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)得結(jié)構(gòu)、 改造酶得不同活性或者動力學(xué)特性 , 改

3、造啟動 子或者 DN作用元件 , 提高蛋白得抗原性或者就是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白得晶體結(jié)構(gòu)，以 及藥物研發(fā)、基因治療等等方面通過設(shè)計(jì)引物 ,并利用 CR將模板擴(kuò)增出來 ,然后去掉模板， 剩下來得就就是我們得 PCR 產(chǎn)物,在PC產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過來了 ,然后再轉(zhuǎn)化 ,篩選陽性克隆， 再測序確定就行 了三、引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)得一般原則不再重復(fù) .突變引物設(shè)計(jì)得特殊原則 :（1 ）通常引物長度為 25 bp, 我們建議引物長度為 335 bp 。一般都就是以要突 變得堿基為中心 , 加上兩邊得一段序列 , 兩邊長度至少為 112 b 。若兩邊引物太短了， 很可能會造成突變實(shí)驗(yàn)失敗， 因?yàn)橐?/p>

4、物至少要 1-1 個(gè) p才能與模板搭上 , 而這種突變 R要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12個(gè) bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)得引物。（2） 如果設(shè)定得引物長度為 0 b,接下來需要計(jì)算引物得 T值 ,瞧就是否達(dá)到 78 （ C含量應(yīng)大于 40）。（3）如果 T值低于 7 ,則適當(dāng)改變引物得長度以使其 Tm值達(dá)到 7 （G含量應(yīng) 大于 %）。（4 ）設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物得中央位置 .（5） 最好使用經(jīng)過純化得引物。T 值計(jì)算公式： Tm=0、41×（ of GC） 675/L+81 、注： L:引物堿基數(shù) ;% o G :引物含量 .四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以 GG

5、ACG為例： CCTC CA TATGTAGCGA TTACT A TGCGG3-'（1） 首先設(shè)計(jì) 30 bp 長得上下游引物，并將 A （T ）設(shè)計(jì)在引物得中央位置Pimer #1: ' CCTATATTGAGCTTACTT TTC3'rimer 2: 5 ' GCAAT AGT AGC TCTAC TACTGAA G3'（2） 引物 GC含量為 40%,L為 30,將這兩個(gè)數(shù)值帶入 T值計(jì)算公式，得到其 Tm=5、 （Tm=0、4×40-675/30+8 、）。通過計(jì)算可以瞧出其 Tm低于 78, 這樣得引物就是不 合適得 ,所以必須調(diào)整

6、引物長度（ 3）重新調(diào)整引物長度Prim r 1：' -CTCTCATATGTCATTACTTATTGGCG'P ime #2: 5 'CGCAATAATAAGTCTGCTCAACTGAAG' 在引物兩端加 5mr（ 斜體下劃線處 ） ，這樣引物得 GC含量為 45、7%,L值為 35, 將這兩 個(gè)數(shù)值帶入 Tm值計(jì)算公式，得到其 Tm為 80、952（T =0、41×4、 5 67/ 5+8、 ） ， 這樣得引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了 .五、突變所用聚合酶及 Bu r引物與質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就就是做PCR嘍,不過對于 PR得酶與 b fer ，不能用

7、平時(shí)得 ,我們做 R把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來 , 延伸長度達(dá)到幾個(gè) K，所以要用那些 C buf r 或擴(kuò)增長片段得 fer, 另外，要用保真性能較好得 PF酶來擴(kuò)增 , 防止引進(jìn)新得突 變。除了使用基因定點(diǎn)突變試劑盒 ,如 Stra agene與塞百盛得試劑盒，但價(jià)格昂貴?？梢?使用高保真得聚合酶，如博大泰克得金牌快速ta 酶、 akara 得 P imeSTARTM S N p ymeras。六、如何去掉 PR產(chǎn)物最簡單得方法就就是用 DpnI 酶，DpnI 能夠識別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用得模板 一般都就是雙鏈超螺旋質(zhì)粒 , 從大腸桿菌里提出來得質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來（除非您 用得就是甲

8、基化缺陷型得菌株） ，而 PCR產(chǎn)物都就是沒有甲基化得，所以 pnI 酶能夠特異 性地切割模板（質(zhì)粒）而不會影響 PCR產(chǎn)物 ,從而去掉模板留下 PCR產(chǎn)物, 所以提質(zhì)粒時(shí)那些 菌株一定不能就是甲基化缺陷株 .pnI 處理得時(shí)間最好長一點(diǎn) , 最少一個(gè)小時(shí)吧 ,最好能有兩三個(gè)小時(shí)， 因?yàn)槿绻０逄?理得不干凈 , 哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長出來,就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗 .七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過 DpnI 處理得 PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了 , 然后再篩選出陽性克隆 , 并提出質(zhì) 粒, 拿去測序 ,驗(yàn)證突變結(jié)果。八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟recA 誘導(dǎo)突變基因（ CR反應(yīng)）以待突變得

9、質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)得引物及Mu ad?酶進(jìn)行 PR擴(kuò)增反應(yīng) , 誘導(dǎo)目得基因突變 .1、設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物 .注 參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)、 準(zhǔn)備模板質(zhì)粒 DN A5 注用 dam+型菌株（例如 DH5 菌株 ）作為宿主菌。 在 d型菌株中常有克隆數(shù)低得現(xiàn)象 但就是對突變效率沒有影響。提取質(zhì)粒NA時(shí)我們建議您使用本公司得質(zhì)粒提純試劑盒。3、 選項(xiàng) 對照反應(yīng)體系 （5 l反應(yīng)體系）10×R ctio B ff r5lpC8 onrl asm d（ 0 g ， to al 0ng）Cntr l pri r mix( 0pmol/l)2ld TP ixtu e( each .5mM)2lH23lMut

10、 -dir t? En e1l、 樣品反應(yīng)體系 （ 0l反應(yīng)體系 ）10× Reaction Buff rSample plasmid（ 0g/l， total20n）2Sam le pr me （F）（ 0pmo /l）1lSample prime （R ）（ pm l ） TP mixt re（ ach 。 5mM）2dHO38lMu -direc ? Enzyme1l5、 PC反應(yīng)條件注 按如下參數(shù)設(shè)置 CR擴(kuò)增條件。Cycle Temperat reR ci n Time1 ycle53se15 y le930se551m n721mi per pl smid b6、 CR擴(kuò)

11、增反應(yīng)完成后冰育分鐘，然后置于室溫（ 避免反復(fù)凍融 ） 。 注 按下列提供得 CR 條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制 PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過 4 個(gè)時(shí) 會發(fā)生突變率降低得現(xiàn)象。Muttion ycle 12Nucle ti 15 ycles3Nu le t de1 cycle B 突變質(zhì)粒選擇 PC反應(yīng)結(jié)束后使用 Mu zyme?酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA.1、 準(zhǔn)備反應(yīng)產(chǎn)物2、加入 l （ 10/ l）Mutazy ?酶 7溫育 1小時(shí) .注 當(dāng)質(zhì)粒 DNA用量過多時(shí) tazyme?酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全得現(xiàn)象。因此我們建 議為了保證突變率請嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作 如果突變率

12、低， 可以適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間或 增加 Muta me?酶用量。C 轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒 DNA上會產(chǎn)生缺口 ,當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒 DA轉(zhuǎn)入 E、ol 中時(shí)請選擇 dam+ 型菌株 , 例如 DH5。、 將 10l樣品加到 0l 感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上分鐘。2、 接下來可以參照一般得轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行 序列分析通常當(dāng) L平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。 為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對白色單菌落進(jìn)行測序分析。先講最簡單得一個(gè)點(diǎn)得定點(diǎn)突變技術(shù) , 其它較長片段得突變 ,刪除,插入技術(shù)以后會慢慢 奉上：在做實(shí)驗(yàn)之前 , 我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)得目得與實(shí)驗(yàn)得原理。 ? 實(shí)驗(yàn)得目得應(yīng)該 比較明確吧 : 就就是要把自

13、己得基因上面得一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。一般情況下我們會 有幾種可能使我們需要這樣去做：第一 :我們吊出來得基因有點(diǎn)突變，相信這可能就是大家經(jīng)常會遇到得問題?；蚝貌蝗菀?吊出來 , 并裝進(jìn)了自己得載體 , 卻發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)堿基跟自己得預(yù)期序列或所有得公共數(shù)據(jù)庫 不匹配，然后暴昏。大家實(shí)驗(yàn)室里面還就是用 Ta酶為主吧， Pfu 這樣得高保真酶大家應(yīng)該用得不多 吧,Taq 酶得優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就就是保真性差, 其錯(cuò)配機(jī)率就是比較高得，相關(guān)數(shù)字忘了 , 大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字 , 不過感覺如果就是 200bp 得基因 , 如果擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)得話，很大機(jī)率會出現(xiàn)點(diǎn)突變，

14、當(dāng)然這也跟具體PCR體系里得B fer 有很大關(guān)系，詳細(xì)情況這里就不討論了。第二 : 要研究基因得功能 , 在基因上自己選定位置更換堿基得保守序列 , 或者改造成不同得亞 型, 總之就就是要人工改造堿基序列符合自己得實(shí)驗(yàn)需要，相信這也就是那些研究基因得人 經(jīng)常得一種思路吧。對于第一種情況 :我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配得位置就是不就是重要得位置 , 如果 不就是很重要 , 大可不必管它 ,比如說就是三聯(lián)密碼子得最后一位 , 堿基得改變并沒有引起相 應(yīng)氨基酸得改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外, 在 NC上人類得基因得版本一直在變化 ,也就就是說同一個(gè)基因有不同得版本 , 或者稱不同得亞型

15、， 其堿基序列有些許得差 異, 只要自己克隆出來得堿基序列與其中一個(gè)相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果 有時(shí)間沒錢 , 那干脆重新 P R然后再克隆進(jìn)自己得載體了， 不過最好換個(gè)保真性好一點(diǎn)得酶 如 P U,或者 PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn) , 不過這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦 . 實(shí)在不行得話再來做定 點(diǎn)突變 . ?對于第二種情況 :這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了 .接下來開始聊一聊定點(diǎn)突變得原理吧， 那個(gè) Str agene 試劑盒！上面有一個(gè)說明書 , 說得好像很正規(guī) , 不過上面好多都就是什么專利啊什么注意之類得話， 瞧都不瞧 , 我們簡明扼 要地只講實(shí)驗(yàn)方面，通過設(shè)計(jì)引物，并利用PR

16、將模板擴(kuò)增出來 ,然后去掉模板 , 剩下來得就就是我們得 CR產(chǎn)物, 在 CR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過來了 , 然后再轉(zhuǎn)化 ,篩選陽性克 隆, 再測序確定就行了。大家馬上就會想到幾個(gè)問題了 :?第一 : 引物怎么設(shè)計(jì)呢 ?第二 : 模板怎么去掉呢？ ?第三：怎 么拿到質(zhì)粒呢 ?對于第一個(gè)問題：怎么設(shè)計(jì)引物 ? 我只能講一些原則 , 并舉一些例子。 引物設(shè)計(jì)得原則其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了：不過這種突變引物要加上一個(gè)原則：般都就是以要突變得堿基為中心，加上兩邊得一段序列 ,兩邊長度至少為 112bs p ir 。? 若兩邊引物太短了 ,很可能會造成突 變實(shí)驗(yàn)失敗，大家應(yīng)該都知道，引物至少要

17、1112個(gè) base ai 才能與模板搭上，而這種突變 CR要求兩邊都能與引物搭上 ,所以兩邊最好各設(shè)至少 12個(gè)bae r, 并且合 成多一條反向互補(bǔ)得引物。這么說大家可能不就是很清楚 , 那我就舉個(gè)例子吧 :71 6、 1 TTCAGGGAATTTGAACTTTACAAAATTGGAT AAAAAAGAATTCCA 60 ?現(xiàn)有序列 ATCAGGAGGAATTTGCATTTACAGAT GAAAAAAAAGAGGATTCCAG 924?* *?|- deletionX716 1、 AAGGC ACCCCGACCTCCAAGGGCTGCG GGAATATTTGAGAGTGT A T 020現(xiàn)

18、有序列 AA G CA C GACCTCCAGGG GCTCGAGGAATTTG AGTGTAGGA T 8（ 上面為目得序列， 下面為現(xiàn)有序列 : 我們發(fā)現(xiàn)有一個(gè) A 堿基得缺失 , 其直接結(jié)果就是在表達(dá)蛋白時(shí)后面得氨基酸全部錯(cuò)配）我們以它為中心設(shè)計(jì)引物：兩邊各至少12個(gè)堿基 ,左邊由于含有較多得 A造成引物GC含量過低，故拉長引物使 C含量不至過低 , 也使引物退火溫度升高。故合成引物 CA AGA TTGGATA AAAAGAGGAATCAGAA 并合成反向互補(bǔ)引物 CT CTG ATTC CTTTTTTATCATCTTGTTG 其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列， 只要反向引物也就是兩邊都有大

19、于12 個(gè)堿基 ,同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)得原則就行了 .引物合成公司有很多家 , 大家可以去尋找 , 不同廠家得引物在價(jià)錢質(zhì)量上有一些差別 , 不過價(jià)錢一般都就是一塊多一個(gè)堿基, 合成時(shí)間約為一周 .這樣得結(jié)果就是 PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來了 ,得到得 PC產(chǎn)物就是一條鏈完整 ,另 一鏈有缺刻得 PCR產(chǎn)物對于第二個(gè)問題 : ? 怎么去掉模板呢 ?再簡單得方法就就是用 DnI 酶， DnI 能夠識別 甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用得模板一般都就是雙鏈超螺旋質(zhì)粒 , 從大腸桿菌里提出來得 質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來 （除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株） ，而 PC產(chǎn)物都就是沒有甲基化得 ,所以 Dn

20、酶能夠特異性地切割模板 （質(zhì)粒）而不會影響 R產(chǎn)物, 從而去 掉模板留下 PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株, 不會那么湊巧吧 ,哈哈。關(guān)于第三個(gè)問題： ? 直接把通過 Dpn處理得 PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了 , 呵呵, 然后 再篩選出陽性克隆 ,并提出質(zhì)粒 ,拿去測序 （這個(gè)就不用我多說了吧） ,驗(yàn)證突變結(jié)果 ,一般都 沒問題得啦 , 我做了幾十個(gè)突變了 , 到目前為止還沒有做不出來得，呵呵，不要砸我啊。 下面講一下具體得實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意得事情: 1?、 根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物 ;2、合成引物并準(zhǔn)備好模板；3、PC ,4、Dp I 處理酶切產(chǎn)物 ;5、轉(zhuǎn)化酶

21、切產(chǎn)物 ; 6?、 篩選 陽性克隆； ?、 送測序并測全長 . ?最后就就是慶祝啦 , 呵呵 , 沒什么復(fù)雜得。引物與質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就就是做PCR嘍,不過對于 PCR得酶與 buf r, 不能用平時(shí)得 ,我們做 PR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來 , 延伸長度達(dá)到幾個(gè) K，所以要用那些 G bffer 或擴(kuò)增長片段得 buffer ，另外，要用保真性能較好得 PFU酶來擴(kuò)增 , 防止引進(jìn)新得突變。 那種 i k c an e 試劑盒分為幾種不同得類型什么 i Change? Si irected Mutag n si it 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變試劑盒 、 Q Ch ge? XL -Direc ed M tage

22、nesis Kit 長模板單點(diǎn)突變試劑盒 （ 8b）從原理上就是一樣得， 只就是 PCR得酶與 BUFFR不一樣， 后面用了比較適合長片段 擴(kuò)增得酶與 U ER罷了 ,沒什么特別得東西。另外 ,pnI 處理得時(shí)間最好長一點(diǎn)，最少 一個(gè)小時(shí)吧 , 最好能有兩三個(gè)小時(shí) , 因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?, 哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn) , 模板 直接在平板上長出來 , 就會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗 .實(shí)驗(yàn)板長出來得菌有兩種可能 ?一種就是質(zhì)粒 DPN沒處理干凈長出來得 （ 模板 ）, 一種就是 CR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來得（突變體） 不過這兩種菌長得一模一樣 , 即使提出質(zhì)粒來也就是一樣 （酶切與 PCR都無法區(qū)分） ,除 了測序，

23、就是分不出來得 ,做 PCR時(shí)也最好做一個(gè)負(fù)對照 （ 不加引物 ）, 實(shí)驗(yàn)管由于 PCR時(shí)有引物 , 所以在 DNPI 處理前里面既含有模板又含有 P產(chǎn)物， 而對照管 由于 PCR時(shí)沒放引物 ,所以在 DNI 處理前里面只有模板。 ?如果兩者都拿去 DNPI處理 ?就 能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈 .若實(shí)驗(yàn)順利得話應(yīng)該就是 : 正對照長菌負(fù)對照不長菌。 如果出現(xiàn)正負(fù)對照都長菌 , 那么就就是 DpnI 沒處理好 , 如果正負(fù)對照都不長菌 ,那么有兩種可能 ,一種就是 C陰性 ,也就就是說 PCR出問題了，另 外一個(gè)可能就就是轉(zhuǎn)化出問題了。要搞清楚就是哪個(gè)問題 , 跑膠說明不了問題，那就做個(gè)轉(zhuǎn) 化

24、得對照，拿試劑盒得對照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒問題。如果正對照很多菌 ,負(fù)對照有幾個(gè)菌，那么就就是 PI 處理得不干凈 , 這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn) 氣了 _ 大家有什么問題我們可以繼續(xù)討論 另外，如果大家既沒有 Dpn酶也沒有好得 PCR酶與 UFFE得話，那也有其它辦法進(jìn)行定 點(diǎn)突變 , 只就是麻煩一點(diǎn)，如果大家有需要得話 , 我會把方法貼上來。 ?對于多點(diǎn)突變技術(shù)及 較長片段得缺失插入技術(shù) , 同樣得 , 如果大家有需要得話 ,我會把方法貼上來。不過,如果您有錢得話 ,那就去買那個(gè)試劑盒吧 ,其中 Qik age? Si e irect d Mutag n s s t 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變試劑

25、盒 、 uikC ane? X Site-Direc ed Mt gnesis Ki 長模板單點(diǎn)突變試劑盒 （ kb ）得原理我上面已經(jīng)說了，只就是 補(bǔ)充了一些我認(rèn)為得注意事項(xiàng)。如果您更有錢得話 , 那么您可以叫其它公司幫您做定點(diǎn)突變 服務(wù) ,大約就是改一個(gè)點(diǎn) 100元左右。如果有需要我可以提供公司得聯(lián)系方式。下面我以一個(gè)例子為例來講 100個(gè) bp 以下得堿基插入缺失或者改變實(shí)驗(yàn)方案.其實(shí)這種方案并不就是那么好得，只不過考慮到大家一般都沒有T II 限制性內(nèi)切酶或者 UD and N HII（ 另外兩種方法） , 所以才打算先介紹這種方法 .? 首先先說明一點(diǎn) , 這 種 方法在原理上存在一

26、定成功機(jī)率，也就就是說有運(yùn)氣成分。而定點(diǎn)突變則一般都就是百 分之百成功得， 而這種 100bp 以下得插入缺失或者堿基改變可能要測幾個(gè)克隆才能挑到一個(gè) 好得克隆 , 大家如果要用請慎重考慮 .同樣得，我只變那幾十個(gè)堿基 , 并沒有改變載體及其它地方 , 所以我還就是依賴于 DPNI酶.舉例 :Hmo ains FzE3 就是一個(gè)人類基因，其含有個(gè)氨基酸得信號肽MRDPG ALS LGLCALV ALL L AAGA，后面就是成熟肽 QPYHGE S DHG C P DIAYNQTI P LGHT QE VHQF VKVQCSPELRFFLCSMAVC LDQIPC RSLERRQG ALNKF

27、GF PERLR E PVHGAGEI VQNTSDG PGGGPTAY?TPAPYPDPFTLPPGSDGGRAFPFSCRQ PPYLYRLG RDCGAPCEPGANGLMYF EE RRARLWVGVWSVLCCALSFTVLYVDMRRFSYERPIIFLSGCFMA VHAGFLEDRAV EFSD RVAGTKKEGCTLFMVYGASSIWVIS T?W AA MKWG E I ANSQ H WAVPA KTITILA QV G LLSGVCYVGLSSDA LGFVLAFYFIGTSFAGFVSLFRIRTIMK DTEKEKMVRGVFSV T PATILACYFEQA H

28、W WLLQTCKS VCPPHFPPMS DFTVFMI YLMTM GIT FWIW K QSWRRFYRLSHSSK AV,想在信號肽與成熟肽之間插入一個(gè) FLAG標(biāo)簽并在標(biāo)簽前面加上一個(gè) eucin 。即在信號肽與成熟肽之間插入一段序列: TATGATACAGACGTGACGA A（一共三十個(gè) bp）、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) : 信號肽 :AGCGGGACCGGCGCCGTTG TTCGTCCC CTTCTGT CCTG GCTG?GCGC GCTGGGCGCACGTCCG CGGGC 成熟肽 :CAGCC TACC GG GAGAA GGCACTCGTGC GA C C TCGCCAGCCCAT

29、CCTCCGCT TCA ACATC?GCC CACGACCA CCT C CAACC T CCACA GAACCAAGAGG G GGGCCT GAGGTGCC AGTCTCCGCGGTAAGTGAGGTTCCCGA CTCCG T T?TTCTTTGTCATTAGCCCCGT TGC GTGC GTCA ATCCCGCCG T TTC TGGCGA CGGCCGCC GGGTCGAGCGCTCGAAAAGTTCG CTC? AGTG CCCGAGCGCCTGCGCGAGA TT CGGT ACGGTGCG GAGACTC GT GGCCAG CACG C GAC G C GGGCCCAGG

30、CGGCGGCCCACCCTACCT CCGGCC ACTGCGG CTGCCCTTCACCGCGCTCCCCGGGGCCA GGC?AAGGGGCGTCCCGCCCCCCTCTCATGCCCGTCAGC AAG CC CGTA CTGGCTACCGC CCTGTGAGCGCGATGTGGCGCCCGGGAACCGGGCCGTGC?CAACCCTGATG ACT AAGGAGGAG AGGCGCTCGCCGCCTCTGGTGGCTGTG TCCGTGTGGTCGCTGACGCT AC TTCTCACGTACCTGGTGGATGCGG GCTT GCT CCAGAGCGGCCCAT CTTTGT

31、GGCTTACTTAGTGGCC GT GCGCA G GGCCGGCTTCTTTCTA CGCCGTG CGTGG GCGC TCTG GACGAT GCTACCGCCGTGGG AGGG ACAAG AGAGGGCTG CC CCTCTTC TGTCTCTACTTCTCGCAGGC TCCATC GGTGG TCA C GTCT TCA TGGTCTGG GCCGG ATGAA TGG CAGAGCCATCGAGCCA TCGCGTA C TGGCC CG GGCCGTGCCCCCGTCAAGAC TCACTATCCTGG AT GC CGGTAGCGG CTGCTGACGGGGTGTTC

32、GTGCTCTCAGT GAGC ?CTGCGGGCTTCGTGC C CCTCTGT TC CTCTTCAGCACGCCTTC TG?CTGGCCGGCTTCGTTTCTTCCTATC ACCTATAAACAGACGGCACAG ACC GAAGCTG GAAGC CATGGTGCGCATCGCG CGCGT CTCTCA GTG CC CACCAT G CC GCC GCAC CTACGAGCAGGCTCC CGAGACTG GA CCACCTG CCTGCAGACTGCAAGA AGCGTG CTGCCCGCCCGGACTC?C GCCCATGAGCCCCGACTTCACCGTCGTTC

33、TACAAGTGCCTGAT CCATGAT G C GGCATCACCACTGTGTCTGGATCTGGCGGCAAGACCTCGTCTGCGCCC C TAC C TTAGCCA AGCAGCAAGGGAGAG CGGT TGA 插入序列 ?TATGCTCAAGACGATGACACA ?通過引物 3 端大于或等于 18 個(gè)堿基得匹配使引物與模板質(zhì)粒搭配，再通過引物 5 端 得序列來補(bǔ)上那三十個(gè)堿基，先用酶把引物磷酸化 , 再用下面這兩條引物把整個(gè)質(zhì)粒 給擴(kuò)增出來 , 上游與下游引物就剛好把那三十個(gè)堿基給補(bǔ)上了 , 再參照引物得設(shè)計(jì)原則做一 些潤色， 細(xì)心得朋友可以具體分析一下這兩條引物 . 擴(kuò)出來后再用 NI 酶把模板質(zhì)粒去掉 再用連接酶把 C產(chǎn)物得兩端連接起來 （ 雖然就是平端連接 , 可就是由于就是同一條 PCR 產(chǎn)物得兩端連接 , 效率會很高） , 轉(zhuǎn)化后 , 測序驗(yàn)證 , K.設(shè)計(jì)引物for ad pr mer:GACTACAAAGAGATGAGAAAGGCCGTACCAC AGAGAAG 88、 5?rsrve pri er： TTAAGCC GGGCCGGGACAG8T6?、 ?但就是由于引物得合