從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測(cè)定設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案一、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中,是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過(guò)程中均有重要價(jià)值,如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研【】究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模

2、的應(yīng)用1。常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見(jiàn)產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽【】【】孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌2、凝結(jié)芽孢3。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤【】和植物體表面及水體中4。所以此次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?了解生物分離提純的原理和方法技術(shù)2掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理和方法4.培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)方法的能力5.培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析問(wèn)題解決問(wèn)題和判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。三、實(shí)驗(yàn)原理自然界

3、中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和生命活 動(dòng)中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說(shuō)，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10 cm30 cm的【】土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少5。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的

4、是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。 芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽(yáng)性；接觸酶陽(yáng)性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營(yíng)養(yǎng)體的最高生長(zhǎng)溫度大約從25到75以上；最低生長(zhǎng)溫度大約5到45；生長(zhǎng)最低pH值，從7.58到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營(yíng)養(yǎng)明膠（22）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上?？莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯

5、糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的最低限培養(yǎng)基是無(wú)維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和【】。一個(gè)氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源6四、實(shí)驗(yàn)材料和用具 4.1 土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和文科樓旁邊的桑園內(nèi)的土壤，以及郭培國(guó)老師的種植園內(nèi)的土壤、演藝中心旁的土壤。4.2 營(yíng)養(yǎng)瓊脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉0.5 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化鈉0.5 瓊脂1.52

6、.0 校正pH至7.27.44.4 發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米粉 2 黃豆餅粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 檸檬酸鈉 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.04.5 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.27.44.6 蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗(yàn)用）（%）：蛋白胨1% 氯化鈉0.5% 校正pH 7.27.44.7 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%）：氯化鈉0.5 硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.02 磷酸二氫銨0.1 磷酸氫二鉀0

7、.1 檸檬酸0.5 瓊脂2 溴麝香草酚藍(lán)溶液4 酚紅試劑 校正pH6.8先將鹽類溶解于水中，校正pH，再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混勻后分裝試管，121高溫滅菌15min。4.8 配制營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調(diào)pH 6.87.04.9耐鹽培養(yǎng)基（%）： 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉2 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉10 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉20 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉25 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.

8、27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.10 溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀綠溶液, 石炭酸復(fù)紅液; 香柏油、二甲苯吲哚試驗(yàn)：乙醚、吲哚試劑V.P.試驗(yàn)：40NaOH溶液、-奈酚，淀粉酶活力測(cè)定：1%3, 5- 二硝基水楊酸試劑4.11 儀器或其它用具無(wú)菌玻璃涂棒 無(wú)菌吸管 接種環(huán) 無(wú)菌培養(yǎng)皿 土樣 三角瓶 燒杯 洗瓶 玻棒 試管 酒精燈 擦鏡紙 接種環(huán) 酒精燈 載玻片 吸水紙等。恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱 高壓蒸汽滅菌箱 超凈工作臺(tái) 水浴箱 紫外燈照射箱 磁力攪拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 顯微鏡五、實(shí)驗(yàn)方法及步驟1、初篩方法制菌懸液

9、：五個(gè)土樣分別取5g，放入各自裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶，振蕩10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個(gè)環(huán)境的土樣裝1個(gè)錐形瓶，共5個(gè)，同時(shí)將其分為10組，編號(hào)ABCDE。加熱篩選有芽孢的菌：將5個(gè)錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無(wú)菌室里），利用恒溫水浴裝置制懸液時(shí)就應(yīng)先開(kāi)始加熱），制成10-1 g/ml的土壤懸液梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無(wú)菌水試管5支，用記號(hào)筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無(wú)菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入10-2的無(wú)菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從

10、10-2的試管中吸取1mL稀釋液加入編號(hào)為10-3的無(wú)菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過(guò)程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來(lái)稀釋。涂布平板 用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開(kāi)始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）。37下恒溫培養(yǎng)24h。2、復(fù)篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60°角，并將接種環(huán)上

11、剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過(guò)第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過(guò)第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于2829°C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來(lái)做染色實(shí)驗(yàn)。3、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個(gè)土樣取8個(gè)平板兩兩標(biāo)記同一位置同序號(hào)標(biāo)記，一平板分5個(gè)區(qū)域，點(diǎn)接重復(fù)兩次，在37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個(gè)

12、分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實(shí)驗(yàn)室，其他置于無(wú)菌室。實(shí)驗(yàn)室里，四個(gè)平板均加入碘液，立即觀察記錄陽(yáng)性和陰性菌落所在位置，并可同時(shí)記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽(yáng)性菌的編號(hào)，利用另一組中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上其對(duì)應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進(jìn)行編號(hào)，然后挑取部分出來(lái)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對(duì)應(yīng)的菌種劃線接種到新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，標(biāo)記，37下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進(jìn)行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進(jìn)行斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨

13、結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。 媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約1520秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染35分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：·取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。·于涂片上滴人35滴5%孔雀綠水溶液。·用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開(kāi)始計(jì)算時(shí)間約45min。加熱過(guò)程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。·傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再

14、褪色為止。·用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min，水洗。·制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽孢的形狀和位置，查伯杰細(xì)菌手冊(cè)）4.斜面保存菌種·貼標(biāo)簽 取各種無(wú)菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口23cm處。（每種菌接3管，標(biāo)上相同編號(hào)也要與平板上菌落編號(hào)相對(duì)應(yīng)）。進(jìn)行斜面接種操作，加塞、包扎好到37培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。5、菌種的鑒定5.1所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài) 、高度 、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢革蘭

15、氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)5.2生理生化試驗(yàn)溫度對(duì)菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗(yàn)；溫度對(duì)菌種的影響；明膠液化試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V.P試驗(yàn))；吲哚試驗(yàn)；耐鹽性試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。·溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板。（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5 到2倍）取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)行標(biāo)號(hào)。 在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個(gè)菌種重復(fù)接種六個(gè)平板。各取每個(gè)菌種兩套平板倒置于4 （冰箱）、37（或者室溫），60下保溫培養(yǎng)24 小時(shí)，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。（“”不生長(zhǎng)，“+”生長(zhǎng)較差 ， “+”生長(zhǎng)一

16、般，“+”生長(zhǎng)良好。·淀粉水解實(shí)驗(yàn)以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)劃“+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1培養(yǎng)24-48h，或于20培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜

17、保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。·糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵）用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒(méi)有標(biāo)簽和標(biāo)識(shí)的另外一端，注意保留標(biāo)簽和糖的名稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對(duì)應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對(duì)照。注意接種的整個(gè)過(guò)程中，不能人為的制造氣泡，若發(fā)酵管內(nèi)有氣泡，則輕輕甩動(dòng)發(fā)酵管直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應(yīng)重做一管。接種后，每一管外包一層無(wú)菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小燒杯內(nèi)，37培養(yǎng)24h。觀察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用

18、該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒(méi)有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”。 ·乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(VP試驗(yàn))標(biāo)記試管 ：取裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，編號(hào)。接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)24h。觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40NaOH溶液1020滴，并加等量-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V

19、.P.試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)（用“”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陰性反應(yīng)（用“”表示）。·吲哚試驗(yàn)試管標(biāo)記取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管，編號(hào)。接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接種，置37恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察記錄在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時(shí)沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動(dòng)試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，否則為陰性反應(yīng)，陽(yáng)性用“”、陰性用“”表示。·耐鹽性試驗(yàn)將分離獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度

20、為2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置37下培養(yǎng),觀察生長(zhǎng)情況 7。·檸檬酸鹽試驗(yàn)取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基的試管分別標(biāo)記待測(cè)菌種的編號(hào)和空白對(duì)照以無(wú)菌操作分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長(zhǎng)，即為陽(yáng)性反應(yīng)，以“”表【】示。若培養(yǎng)基仍為綠色則為陰性反應(yīng)，以“”表示8。6、產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測(cè)定發(fā)酵：將初篩純菌種接種于30/250mL 種子培養(yǎng)基,37 、250r/min搖床培養(yǎng)過(guò)夜。種子液以2 %接種量接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基50/500mL ,相同條件培養(yǎng)72h ,發(fā)酵8000r/min，離心10min ,取上清液測(cè)酶活, 每個(gè)樣品重復(fù)3 次,最后結(jié)果取平均值。在Young等方法的基礎(chǔ)上作了改進(jìn)：取5ml 0.5%的可溶性淀粉溶液，在40水浴中預(yù)熱10min，然后加適當(dāng)稀釋的酶液0.5ml，反應(yīng)5min后，用5ml 0.1mol/L H2SO4終止反應(yīng)。取0.5ml反應(yīng)液與5ml碘液顯色，在620nm處測(cè)光密度。以0.5ml水代替0.5ml反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加同樣體積的緩沖液）的管為對(duì)照。酶活力根據(jù)下式計(jì)算：酶活力（u/ml）=(R-r)/R*50*D式中R、r分別表示對(duì)照和反應(yīng)液的光密度，D為酶的稀釋倍數(shù)。調(diào)整D使（R-r）