高原低氧對大鼠下丘腦生長抑素和γ-氨基丁酸含量的影響

1、    高原低氧對大鼠下丘腦生長抑素和-氨基丁酸含量的影響        摘要目的: 觀察高原低氧大鼠下丘腦前生長抑素原(PPS)mRNA和-氨基丁酸(GABA)含量變化。方法: 應用大鼠高原低氧模型及原位雜交技術(shù)和氨基酸測定法, 檢測下丘腦前PPS-mRNA神經(jīng)元數(shù)量和GABA的含量。結(jié)果: 高原低氧組大鼠下丘腦GABA的含量明顯增多,室周核、室旁核、弓狀核PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目增加; 而GABA受體拮抗劑荷包牡丹堿使高原低氧大鼠下丘腦PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目

2、增多更為顯著, 但對GABA含量的增加影響不大。結(jié)論:高原低氧可導致下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂。 主題詞高海拔；低氧; 生長抑素；RNA，信使; 氨基丁酸類中分類號 Q 459文獻標識碼 A文章編號1000-4718(2000)01-0017-03 Effect of altitude hypoxia on somatostatin and -aminobutyric acid content of rat hypothalamusRUAN Huai-zhen, FAN Xiao-tang, ZHANG Jin-hai, YUAN Bi-bo, WU Xi-gui(Department of Ne

3、urobiology, Third Military Medical University, Chongqing 400038,China)AbstractAIM:To observe the effect of altitude hypoxia on -aminobutyric (GABA) content and prepro-somatostatin mRNA (PPS-mRNA) in the rat hypothalamus. METHODS: Using altitude hypoxia model,in situ hybridization and amino acid anal

4、yzer, the number of PPS-mRNA and GABA content in rat hypothalamus was determined. RESULTS:After altitude hypoxia, the contents of GABA in hypothalamus and the number of PPS-mRNA neurons in periventricular nucleus (PeVN), paraventricular nucleus (PaVN) and arcuate nucleus (ArcN) increased significian

5、tly. Bicuculline, a GABA receptor antagonits, could enhance PPS-mRNA expression evoked by altitude hypoxia, but had no effect on GABA content. CONCLUSION: Altitude hypoxia can induce neurotransmitter imbalance of hypothalamus.MeSHAltitude; Anoxia; Somatostatin; RNA, messenger; Aminobutyric acids生長抑素

6、(somatostatin, SOM)不僅是下丘腦分泌的一種調(diào)節(jié)性多肽，而且是一種作用廣泛、功效很強的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)物,&127;它參與了機體多種生理功能的活動和調(diào)節(jié)。下丘腦SOM神經(jīng)元還接受-氨基丁酸 (-aminobutyric acid, GABA )末梢的支配1,它們之間的關(guān)系一般是相互抑制其釋放或相互抑制其功能2。 但是在高原低氧環(huán)境中, 下丘腦GABA與SOM的變化及關(guān)系,尚不清楚。本文應用原位雜交技術(shù)和氨基酸測定法研究高原低氧大鼠下丘腦內(nèi)PPS-mRNA的表達和GABA含量的變化。材 料 和 方 法(一)動物模型及分組： 實驗用SD大鼠77只,體重為150200 g,

7、 雌雄不拘。隨機分為正常對照組(室溫常氧)、低氧1, 3, 7 d組及荷苞牡丹堿(bicuculline, Bic)+ 低氧1,3,7 d組(每組11只,5只進行原位雜交染色,6只進行GABA含量測定),將大鼠置于模擬海拔6000 m的低壓艙內(nèi)(艙內(nèi)溫度為4), 每天6h。(二) GABA的提取及含量測定：大鼠斷頭，迅速取出下丘腦，精確稱重。置樣品于冰鎮(zhèn)玻管中，加入10%磺基水楊酸(1 mL)，冰浴下以玻璃勻漿器手動勻漿并離心(4 ,15 000 r/min, 30 min)，取上清液50 L，用美國Beckman-6300黃金系列高效氨基酸分析儀檢測GABA的含量。分析條件如下:柱高10 c

8、m，柱溫77 ，鋰緩沖液(Li-F)，茚三酮的流速為10 mL/h,比色波長為570 nm。(三) 前生長抑素原mRNA原位雜交法： 實驗畢, 按常規(guī)進行大鼠腦組織灌流, 固定,取出下丘腦,行冠狀連續(xù)切片(35 m), 然后以地高辛標記的反義cRNA探針(400 bp)按文獻3敘述步驟進行原位雜交前、雜交和雜交后處理(雜交過程中的溫度是恒度的,不需要調(diào)節(jié))。抗地高辛抗體工作濃度為11000, 以NBT/BCIP (400 g.mL-1/200 g.mL-1結(jié) 果(一) 高原低氧對大鼠下丘腦GABA含量的影響： 由表1可見,下丘腦GABA的含量在高原低氧第1 d即開始增加, 3 d和7 d組均明

9、顯多于對照組(P0.01)。每天進艙前腹腔注射GABA受體拮抗劑荷包牡丹堿( Bic, 1.5 mg/kg),觀察到與同一時間單純低氧組比較,大鼠下丘腦GABA含量變化不大。 (二) 高原低氧對大鼠下丘腦PPS-mRNA的影響 ：大鼠下丘腦室周核(periventricular nucleus, PeVN), 室旁核(paraventricular nucleus, PaVN), 弓狀核(arcuate nucleus,ArcN) PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目在低氧的第1 d即開始增加, 3 d和7 d組仍很明顯(表2; 1a,b)。每天進艙前腹腔注射GABA受體拮抗劑荷包牡丹堿(Bic,

10、1.5 mg/kg),觀察到與同一時間單純低氧組比較, 大鼠下丘腦PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目顯著增加(P0.01, 表2; 1c)。Group GABA contents Control4.16±0.26 1 d 4.97±0.36*3 d 5.22±0.33* 7 d5.92±0.47* Bic+1 d 5.13±0.21* Bic+3 d 5.43±0.35* Bic+7 d6.05±0.51*      ?P<0.05, * P0.01, vs control grou

11、p Bic=bicuculline GroupPeVNPaVNArcNControl22.3±1.5 15.0±2.712.1±0.91 d 56.5±3.1*40.0±2.5*21.5±2.2*3 d58.0±2.9*41.2±3.1*19.7±2.8*7 d 59.2±1.5*39.9±2.7*24.0±1.5*Bic+1 d 72.2±3.2 63.5±2.4 33.5±4.4Bic+3 d 74.3±4.5#62.0±

12、4.5#32.0±3.9#Bic+7 d 77.5±5.059.8±5.237.5±3.2     *P0.01,vs control group；P0.01,vs 1 d group；#P0.01, vs 3 d group; P0.01, vs 7 d group 討論下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)調(diào)節(jié)的中樞,調(diào)控著多種生理功能和生命過程,研究發(fā)現(xiàn),低氧可影響下丘腦TRHmRNA, CRFmRNA和AVPmRNA的表達4。SOM也是下丘腦分泌的一種調(diào)節(jié)性多肽,它參與了機體多種生理功能的活動和調(diào)節(jié),是一種作用廣泛

13、的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)物。大鼠下丘腦正中隆起的SOM可受各種刺激而發(fā)生快速反應性釋放增加5。本文應用高原低氧模型,觀察到下丘腦室周核,室旁核,弓狀核PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目在高原低氧的第1 d即開始增加,3 d和7 d組仍明顯, 證實了高原低氧可增加下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的含量。    a.PPS-mRNA neurons in periventricular nucleus were very sparse in control group (×100)    b.After altitude hypoxi

14、a, PPS-mRNA neurous in periventricular nucleus were densely labeled (7 d,×100)    c.ip bicuculine, PPS-mRNA neurous in periventricular nucleus were increased after altitude hypoxia (7 d,×100)Fig 1(a,b,c) Photomicrograph of PPS-mRNA neurons in the rat hypothalamus1(a,b,c

15、)大鼠下丘腦PPS-mRNA陽性神經(jīng)元顯微照相低氧及缺氧缺血可致中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂, 使腦內(nèi)興奮性和抑制性氨基酸增多6，7, 兩者相互作用共同調(diào)節(jié)SOM的釋放。我們的研究得到了類似的結(jié)果,觀察到下丘腦GABA含量在間斷低氧1 d, 3 d, 7 d均顯著提高。據(jù)報道, 谷氨酸可通過NMDA受體來調(diào)節(jié)SOM 的釋放, 在下丘腦神經(jīng)元的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn), 孵育介質(zhì)中Glu的大量釋放可導致SOM的大量釋放, 而培養(yǎng)液中GABA濃度升高,谷氨酸引起的SOM釋放呈劑量依賴性減少8。我們的研究發(fā)現(xiàn)高原低氧使下丘腦PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目增多,說明興奮性和抑制性氨基酸的比例失調(diào)。GABA是中樞神經(jīng)

16、系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì), 形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn), 下丘腦的室周區(qū)可見GABA能神經(jīng)末梢支配SOM分泌神經(jīng)元1，9,這些解剖的聯(lián)系支持GABA與SOM必然存在功能上的聯(lián)系。通過離體和在體實驗證實, GABA對下丘腦SOM的釋放有內(nèi)源性抑制作用,GABA的內(nèi)源性抑制作用可被荷包牡丹堿和印防己毒素(picrotoxin)兩種GABAA受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn),說明GABA對SOM釋放的抑制作用是通過GABA受體介導的10。我們在實驗中發(fā)現(xiàn),荷包牡丹堿雖然不影響高原低氧引起的大鼠下丘腦GABA含量增多, 但由于阻斷了GABA受體, 使GABA 對SOM的抑制作用減弱, 故下丘腦PPS-mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)目增多更

17、顯著, 證明GABA是通過其受體來抑制SOM的轉(zhuǎn)錄,合成和釋放。目前, 盡管對低氧時腦內(nèi) SOM含量增多的機制還不甚清楚, 但正是由于興奮性和抑制性氨基酸的比例失調(diào),使SOM合成,釋放增加?；痦椖?國家自然科學基金資助(No. 39670283)阮懷珍（第三軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，重慶 400038）范曉棠（第三軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，重慶 400038）張金海（第三軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，重慶 400038）袁碧波（第三軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，重慶 400038）吳喜貴（第三軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室，重慶 400038）參考文獻1陳宜張. 記第31屆國際生理科學大會有關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌領(lǐng)

18、域的報道J. 生理科學進展，1989，20:374376.2Vasko MR, Harris V. Gamma-aminobutyric acid inhibits the potassium-stimulated release of somatostatin from rat spinal cord slices J. Brain Res, 1990，507:129137.3阮懷珍, 李希成, 蔡文琴. P物質(zhì)及福爾馬林增強前生長抑素原mRNA在大鼠脊髓的表達 J. 中國神經(jīng)科學雜志, 1998,14(2):105108.4杜繼增. 低氧影響下丘腦神經(jīng)肽mRNA表達 J. 中國科學院低氧生

19、理開放研究實驗室年報(1991-1993), 1994. 330.5 Aguila MC, Pickle RL, Yu WH, et al. Roles of somatostatin and growth hormone-releasing factor in ether stress inhibition of growth hormone releaseJ. Neuroendocrinology, 1991，54(5):515502.6 Krajnc D, Neff NH, Hadjiconstantinou M. Glutamate,glutamine and glutamine synthetase in the neonatal rat brain following hypoxia J. Brain Res,1996， 707: 134137.7 Fukushima R, Yoshida Y, Chiba S. Long-term effects of postnatal hypoxia on monoamine and amino acid levels in the rat brain J. Yakubutsu Seishin Kodo, 1990，10:335342.8 Rage F, Benyassi A, Aranc