農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草實(shí)驗(yàn)研究

1、ISSN1002-4956CN11-2034/T實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理ExperimentalTechnologyandManagement第27卷 第11期 2010年11月Vol.27 No.11 Nov.2010農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草實(shí)驗(yàn)研究黎 茵,張以順(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣東廣州 510275)摘 要:利用攜帶植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCambia2301的農(nóng)桿菌菌株,通過(guò)注射滲透法對(duì)煙草葉片進(jìn)行感染轉(zhuǎn)化,組織化學(xué)染色檢測(cè)GUS報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)的結(jié)果表明,在O.D.600值為0.40.8范圍內(nèi)的菌液濃度不影響轉(zhuǎn)化效果,感染時(shí)間72h以上可使瞬時(shí)表達(dá)的陽(yáng)性檢出率達(dá)到

2、100%,農(nóng)桿菌菌株EHA105比LBA4404表現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性。關(guān)鍵詞:煙草;瞬時(shí)轉(zhuǎn)化;根癌農(nóng)桿菌;滲透法中圖分類號(hào):Q943.2;S572 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):1002-4956(2010)11-0050-03Studyonagrobacteriumtumefaciens-mediatedtransienttransformationoftobaccobyinfiltrationLiYin,ZhangYishun(BiologyExperimentTeachingCenter,SchoolofLifeSciences,SunYat-senUniversity,Guangzhou5

3、10275,China)Abstract:TransientexpressionofreportgeneGUSintobaccoepidermalcellsisperformedbytheagrobacter-iumtumefaciens-mediatedtransienttransformationsystemwithplantexpressionvectorpCambia2301.Theex-pressionratiosarestablewhenthefinaldilutionofbacterialcellsO.D.600isbetween0.4-0.8.Highestex-pressio

4、nisupto100%requiringonly72hfrominfiltration.AgrobacteriumtumefaciensstrainEHA105givesstrongertransformationactivitythanstrainLBA4404.Keywords:tobacco;transienttransformation;agrobacteriumtumefaciens;infiltration植物的遺傳轉(zhuǎn)化是生物技術(shù)中的一個(gè)十分重要的領(lǐng)域,煙草作為重要的模式植物是最早實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化和應(yīng)用的植物之一。植物轉(zhuǎn)化的常用方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法等。使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉片注射滲

5、透法轉(zhuǎn)化煙草進(jìn)行基因瞬時(shí)表達(dá),是近幾年來(lái)在基因功能檢測(cè)、蛋白作用機(jī)理研究方面使用較多的快速轉(zhuǎn)化技術(shù)1-2,該技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是方便快捷,感染組織面積大,轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)量多3。我們?cè)诮甑膶?shí)驗(yàn)教學(xué)中引入這一實(shí)驗(yàn)技術(shù),不僅能避免通過(guò)組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化方法的耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、容易污染等問(wèn)題,還可以在較短時(shí)間內(nèi)完成從轉(zhuǎn)化到報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)的過(guò)程。收稿日期:2009-12-22 修改日期:2010-03-18基金項(xiàng)目:中山大學(xué)教學(xué)改革項(xiàng)目(1163125);中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究(改革)基金項(xiàng)目(YJ200921)作者簡(jiǎn)介:黎茵(1969),女,廣東省梅縣人,博士,講師,研究方向:植物分子生物學(xué).E-mail:li

6、yin通信作者:張以順(1966),男,貴州省畢節(jié)市人,博士,高級(jí)工程師,中山大學(xué)國(guó)家級(jí)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心副主任,研究方向:植物分子生物學(xué).E1 實(shí)驗(yàn)原理農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以通過(guò)復(fù)制轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞并整合到植物細(xì)胞的基因組中,從而在轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中表達(dá)T-DNA(transferDNA)中編碼的基因。利用農(nóng)桿菌的這一特性可以通過(guò)構(gòu)建T-DNA片段中帶有外源基因的植物轉(zhuǎn)化載體,通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行植物細(xì)胞和組織的遺傳轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)采用的植物表達(dá)載體是pCambia23016(見(jiàn)圖1),該載體T-DNA上帶有35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的B-葡萄糖苷酸酶(B-glucuronidase,GUS)報(bào)告基

7、因,將該載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株,利用注射法轉(zhuǎn)化煙草葉片。由于B-葡萄糖苷酸酶能夠通過(guò)水解B-葡萄糖苷酸酯類底物而生成藍(lán)色化合物,因此通過(guò)組織化學(xué)染色可以檢測(cè)報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)。4-52 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑2.1 儀器超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司,SW-CJ-機(jī)黎 茵,等:農(nóng)桿菌注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草實(shí)驗(yàn)研究51過(guò)夜,菌液濃度達(dá)到O.D.600值為0.81.0。(3)菌液分別經(jīng)40000g離心棄去LB培養(yǎng)基,菌體懸浮于10mmolMgCl2中,添加乙酰丁香酮(As)至終濃度200Lmol/L,懸浮液的濃度調(diào)整到O.D.600值為0.5左右,2528e靜置活化3h。(4)用一次性注射器分別吸取1mL

8、菌液,取針頭在受體葉片上輕刺23個(gè)小孔,將注射器壓在針孔部位,以手指抵住葉片下部,輕輕用力將注射器內(nèi)菌液壓送并滲透到葉片組織中(見(jiàn)圖2),用標(biāo)記筆在注射部位上做好標(biāo)記。圖1 pCambia2301載體圖譜(Eppendorf,5810R);電轉(zhuǎn)儀(BTX,ECM399);光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠,GXZ-128A)或培養(yǎng)室;恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司);電子天平(Sar-torius,BS224S)。另有鑷子、培養(yǎng)皿、三角瓶、試管、容量瓶、注射器等。2.2 材料煙草(NicotianatabacumcvXanthi)為12月齡植株;農(nóng)桿菌菌株LBA4404和EHA1057;植物表

9、達(dá)載體pCambia2301。2.3 試劑(1)LB培養(yǎng)基:含胰化蛋白胨,體積質(zhì)量為10g/L;酵母提取物,體積質(zhì)量為5g/L;NaCl體積質(zhì)量為10g/L,固體培養(yǎng)基加入1.5%瓊脂,滅菌備用。(2)卡那霉素母液:50g/LKan溶液,-20e保存。(3)乙酰丁香酮(As)母液:用二甲基亞砜配成200mmol/L溶液,-20e保存。(4)10mmolMgCl2溶液,滅菌,使用前加入200Lmol/L的乙酰丁香酮(As)。(5)X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-B-葡萄糖苷酸酯)染色液8:50mmol磷酸緩沖液(pH7.2),含1mmolX-Gluc,2mmolK4FeCN6,2mmol

10、K3FeCN6。(6)體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇。圖2 煙草葉片注射示意圖(5)經(jīng)注射的煙草植株在25e下,在14h光照和10h暗的光周期下培養(yǎng)34d。(6)剪取注射部位進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色檢測(cè),葉片材料剪成916mm2小片,并置于X-Gluc染色液中,染色216h。(7)用70%乙醇脫色至葉綠素完全除去,觀察對(duì)比有無(wú)GUS表達(dá)染色現(xiàn)象,記錄并拍照。4 結(jié)果與分析4.1 農(nóng)桿菌菌株對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的影響農(nóng)桿菌EHA105比LBA4404具有較強(qiáng)的侵染毒性,因此在一些轉(zhuǎn)化困難的植物中使用EHA105菌株的轉(zhuǎn)化效果比較好。在本實(shí)驗(yàn)中,EHA105也比LBA4404表現(xiàn)出更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性,在較短時(shí)間內(nèi)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化率

11、較高,并且由于轉(zhuǎn)化效率高而導(dǎo)致的表達(dá)產(chǎn)物積累更多,使組織化學(xué)染色的強(qiáng)度也更高,見(jiàn)表1(表中+號(hào)越多表示越強(qiáng))。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)注射時(shí)懸浮菌液的濃度在O.D.600值為0.40.8之間效果相同,對(duì)轉(zhuǎn)化效率和染色強(qiáng)度無(wú)明顯影響,但濃度過(guò)低則染色強(qiáng)度會(huì)明顯降低,而濃度過(guò)高則由于過(guò)多死亡菌體的存在容易導(dǎo)致注射部位葉片組織壞死。3 實(shí)驗(yàn)方法(1)用于煙草葉片注射的植物表達(dá)載體通過(guò)電擊法9轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中,菌種于-70e保存。(2)帶有轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌和無(wú)轉(zhuǎn)化載體的對(duì)照菌株在含50mg/LKan的LB平板上劃線復(fù)蘇,52實(shí) 驗(yàn) 技 術(shù) 與 管 理表1 農(nóng)桿菌菌株及感染時(shí)間對(duì)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的影響感染時(shí)間/h

12、24487296LBA4404菌株陽(yáng)性檢出率/%染色強(qiáng)度018100100無(wú)+EHA105菌株陽(yáng)性檢出率/%040100100染色強(qiáng)度無(wú)+圖3 煙草葉片GUS基因瞬時(shí)表達(dá)組織化學(xué)染色結(jié)果4.2 感染時(shí)間對(duì)瞬時(shí)表達(dá)的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞需要經(jīng)歷一段時(shí)間,從菌體與細(xì)胞接觸到T-DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)移需要超過(guò)16h的時(shí)間,因此需要在感染后培養(yǎng)足夠時(shí)間才可以進(jìn)行有效的報(bào)告基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在37e染色16h的檢測(cè)條件下,注射后24h的葉片組織檢測(cè)不到明顯的表達(dá),48h后部分煙草葉片組織可以在染色后觀察到顏色較淺的染色結(jié)果,注射后34d報(bào)告基因的表達(dá)檢出率達(dá)到100%,由于GUS蛋白在植物組

13、織中可以比較穩(wěn)定地累積10構(gòu)等研究外,也可以在植物果實(shí)等其他組織中實(shí)施注射法轉(zhuǎn)化12。本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響煙草葉片注射轉(zhuǎn)化法的多項(xiàng)因素進(jìn)行研究,優(yōu)化實(shí)驗(yàn)體系,確定適宜的轉(zhuǎn)化條件,不僅可以很方便地將該轉(zhuǎn)化體系應(yīng)用于本科教學(xué)的實(shí)踐中,也可以利用本方法進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作和基因功能的檢測(cè)研究。參考文獻(xiàn)(References):1ZhangShuqun,LiuYidong.ActivationofSalicylicAcidInducedProteinKinase,aMitogen-ActivatedProteinKinase,InducesMul-tipleDefenseResponsesinTobaccoJ.

14、ThePlantCell,2001(13):1877-1889.2SparkesIA,RunionsJ,KearnsA,etal.Rapid,transientexpres-sionoffluorescentfusionproteinsintobaccoplantsandgenerationofstablytransformedplantsJ.NatureProtocols,2006,1(4):2019-2025.3CazzonellivCI,VeltenJ.Aninvivo,luciferase-based,Agrobacte-rium-infiltrationassaysystem:imp

15、licationsforpost-transcriptionalgenesilencingJ.Planta,2006(224):582-597.4王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程M.2版.北京:科學(xué)出版社,2002:372-395.5HoekemaA,HirschPR,HooykaasPJJ,etal.Abinaryplantvectorstrategybasedonseparationofvir-andT-regionoftheAgrobacteriumtumefaciensT-iplasmidJ.Nature,1983(303):179-80.6pCambia2301EB/OL.(2006-0

16、8-11)./daisy/cambia/2067/version/1/part/4/data/pCAMBIA2301.branch=main&language=default7HoodEE,GelvinSB,MelchersLS,etal.NewagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplantsJ.TransgenicRe-search,1993(218):208-218.8JeffersonRA.Assayingchimericgenesinplants:theGUSgenefusionsystemJ.

17、PlantMolecularBiologyReporter,1987(5):387-405.9薩姆布魯克J,拉塞爾DW.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M.3版.黃培堂,譯.北京:科學(xué)出版社,2002:99-102.10McintoshKB,HulmJL,YoungLW,etal.ARapidAgrobacte-rium-MediatedArabidopsisthalianaTransientAssaySystemJ.PlantMolecularBiologyReporter,2004(22):5361.11VeltenJ,MoreyKJ,CazzonelliCI.PlantviralintergenicDN

18、AsequencerepeatswithtranscriptionenhancingactivityJ.Virolo-gyJournal,2005(2):16-26.12孟楠,劉月學(xué),孫立茹,等.農(nóng)桿菌注射法轉(zhuǎn)化草莓果實(shí)細(xì)胞的研究J.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,40(4):404-407.pdf?11,感染后較長(zhǎng)時(shí)間的葉片組織染色強(qiáng)度也較高,檢測(cè)效果更為明顯。4.3 組織化學(xué)染色條件的優(yōu)化由于檢測(cè)GUS基因瞬時(shí)表達(dá)的組織化學(xué)染色方法所采用的是活組織染色,控制好染色條件是得到較好染色結(jié)果的關(guān)鍵。首先剪取材料時(shí)應(yīng)盡量減少葉片細(xì)胞的損傷,取樣后立即進(jìn)行染色。如果有條件對(duì)加入染色液的材料進(jìn)行真空處理5min,能有效促進(jìn)染色液滲入組織,加強(qiáng)染色效果和均勻度;未經(jīng)真空處理的染色材料